Peranan enzim dan sitokin dalam patogenesis osteoarthritis

Dalam tahun-tahun kebelakangan ini, banyak perhatian penyelidik telah tertumpu pada mengenal pasti protease yang bertanggungjawab terhadap kemerosotan ECM rawan artikular dalam osteoarthrosis. Menurut konsep moden, matriks metalloproteases (MMPs) memainkan peranan penting dalam patogenesis osteoarthrosis. Pada pesakit dengan osteoarthrosis, tahap peningkatan tiga MMP dikesan - kolagenase, stromelysins dan gelatinases. Kolagenase bertanggungjawab untuk degradasi kolagen asli, stromelysin - jenis IV kolagen, proteoglycans dan laminin, gelatinase - untuk degradasi gelatin, kolagen IV, jenis Vh XI, elastin. Di samping itu, kehadiran enzim lain - aggrecanase, yang mempunyai sifat MMP dan bertanggungjawab untuk proteolisis agregat proteoglycan cartilaginous, diandaikan.

Tiga jenis kolagenase telah dikenal pasti dalam rawan artikular manusia, tahapnya meningkat dengan ketara pada pesakit osteoarthritis: kolagenase-1 (MMP-1), kolagenase-2 (MMP-8), dan kolagenase-3 (MMP-13). Kewujudan bersama tiga jenis kolagenase yang berbeza dalam rawan artikular menunjukkan bahawa setiap daripada mereka memainkan peranan khususnya sendiri. Sesungguhnya, kolagenase-1 dan -2 dilokalkan terutamanya di zon perantaraan dangkal dan atas rawan artikular, manakala kolagenase-3 ditemui di zon perantaraan bawah dan di zon dalam. Selain itu, hasil kajian imunohistokimia menunjukkan bahawa apabila osteoartritis berkembang, tahap kolagenase-3 mencapai dataran tinggi dan malah berkurangan, manakala tahap kolagenase-1 secara beransur-ansur meningkat. Terdapat bukti bahawa dalam osteoarthritis, kolagenase-1 terutamanya terlibat dalam proses keradangan dalam rawan artikular, manakala kolagenase-3 terlibat dalam pembentukan semula tisu. Kolagenase-3, yang dinyatakan dalam rawan pesakit dengan OA, merendahkan kolagen jenis II dengan lebih intensif daripada kolagenase-1.

Daripada wakil kumpulan kedua metalloprotease, tiga juga telah dikenal pasti dalam stromelysin manusia: stromelysin-1 (MMP-3), stromelysin-2 (MMP-10), dan stromelysin-3 (MMP-11). Hari ini, diketahui bahawa hanya stromelysin-1 yang terlibat dalam proses patologi dalam osteoarthrosis. Stromelysin-2 tidak dikesan dalam membran sinovial pesakit dengan osteoarthrosis, tetapi ia didapati dalam kuantiti yang sangat kecil dalam fibroblas sinovial pesakit dengan arthritis rheumatoid. Stromelysin-3 juga terdapat dalam membran sinovial pesakit dengan arthritis rheumatoid berhampiran fibroblas, terutamanya dalam zon fibrosis.

Dalam kumpulan gelatinases dalam tisu rawan manusia, hanya dua yang telah dikenal pasti: 92 kD gelatinase (gelatinase B, atau MMP-9) dan 72 kD gelatinase (gelatinase A, atau MMP-2); pada pesakit dengan osteoarthritis, peningkatan tahap 92 kD gelatinase ditentukan.

Baru-baru ini, satu lagi kumpulan MMP telah dikenal pasti yang disetempatkan pada permukaan membran sel dan dipanggil MMP jenis membran (MMP-MT). Kumpulan ini termasuk empat enzim - MMP-MT1 - MMP-MT-4. Ekspresi MMP-MT telah ditemui dalam rawan artikular manusia. Walaupun MMP-MT-1 mempunyai sifat kolagenase, kedua-dua enzim MMP-MT-1 dan MMP-MT-2 mampu mengaktifkan gelatinase-72 kDa dan kolagenase-3. Peranan kumpulan MMP ini dalam patogenesis OA memerlukan penjelasan.

Proteinase dirembeskan dalam bentuk zymogen, yang diaktifkan oleh proteinase lain atau sebatian merkuri organik. Aktiviti pemangkin MMP bergantung kepada kehadiran zink dalam zon aktif enzim.

Aktiviti biologi MMP dikawal oleh TIMP tertentu. Sehingga kini, tiga jenis TIMP telah dikenal pasti yang terdapat dalam tisu artikular manusia: TIMP-1–TIMP-3. Jenis TIMP keempat telah dikenal pasti dan diklon, tetapi ia masih belum dikesan dalam tisu artikular manusia. Molekul-molekul ini secara khusus mengikat tapak aktif MMP, walaupun sebahagian daripadanya dapat mengikat tapak aktif 72 kD progelatinase (TIMP-2, -3, -4) dan 92 kD progelatinase (TIMP-1 dan -3). Bukti menunjukkan bahawa dalam OA, terdapat ketidakseimbangan antara MMP dan TIMP dalam rawan artikular, mengakibatkan kekurangan relatif perencat, mungkin sebahagiannya disebabkan oleh peningkatan tahap MMP aktif dalam tisu. TIMP-1 dan -2 terdapat dalam rawan artikular dan disintesis oleh kondrosit. Dalam osteoarthrosis, hanya TIMP jenis I dikesan dalam membran sinovial dan cecair sinovial. TIMP-3 didapati secara eksklusif dalam ECM. TIMP-4 berkongsi hampir 50% daripada jujukan asid aminonya dengan TIMP-2 dan 38% dengan TIMP-1. Dalam sel sasaran lain, TIMP-4 bertanggungjawab untuk memodulasi pengaktifan 72 kD progelatinase pada permukaan sel, menunjukkan peranan penting sebagai pengawal selia khusus tisu bagi pembentukan semula ECM.

Mekanisme lain untuk mengawal aktiviti biologi MMP ialah pengaktifan fisiologi mereka. Adalah dipercayai bahawa enzim daripada keluarga protease serin dan sistein, seperti AP/plasmin dan cathepsin B, masing-masing, adalah pengaktif fisiologi MMP. Peningkatan tahap urokinase (uAP) dan plasmin telah ditemui dalam rawan artikular pesakit dengan osteoarthritis.

Walaupun fakta bahawa beberapa jenis cathepsin terdapat dalam tisu sendi, cathepsin-B dianggap sebagai pengaktif MMP yang paling berkemungkinan dalam tulang rawan. Perencat fisiologi serin dan protease sistein telah ditemui dalam tisu sendi manusia. Aktiviti perencat AP-1 (IAI-1), serta protease sistein, dikurangkan pada pesakit dengan osteoarthritis. Sama seperti MMP/TIMP, ketidakseimbangan antara protease serin dan sistein dan perencatnya yang boleh menjelaskan peningkatan aktiviti MMP dalam rawan artikular pesakit osteoarthritis. Di samping itu, MMP dapat mengaktifkan satu sama lain. Sebagai contoh, stromelysin-1 mengaktifkan kolagenase-1, kolagenase-3, dan 92 kD gelatinase; kolagenase-3 mengaktifkan 92 kD gelatinase; MMP-MT mengaktifkan kolagenase-3, dan gelatinase-72 kDa mempotensikan pengaktifan ini; MMP-MT juga mengaktifkan gelatinase 72 kDa. Sitokin boleh dibahagikan kepada tiga kumpulan - merosakkan (radang), pengawalseliaan (termasuk anti-radang) dan anabolik (faktor pertumbuhan).

Jenis sitokin (mengikut van den Berg WB et al)

Memusnahkan	Interleukin-1 TNF-a Faktor penghalang leukemia Interleukin-17
Kawal selia	Interleukin-4 Interleukin-10 Interleukin-13 Perencat enzim
Anabolik	Faktor pertumbuhan seperti mnsulin TGF-b Protein morfogenetik tulang Protein morfogenetik berasal dari rawan

Sitokin yang merosakkan, khususnya IL-1, mendorong peningkatan dalam pembebasan protease dan menghalang sintesis proteoglikan dan kolagen oleh kondrosit. Sitokin kawal selia, khususnya IL-4 dan -10, menghalang pengeluaran IL-1, meningkatkan pengeluaran antagonis reseptor IL-1 (IL-1RA) dan mengurangkan tahap NO sintase dalam kondrosit. Oleh itu, IL-4 menentang IL-1 dalam tiga arah: 1) mengurangkan pengeluaran, mencegah kesannya, 2) meningkatkan pengeluaran "pemulung" utama IL-1RA dan 3) mengurangkan pengeluaran "messenger" sekunder utama NO. Di samping itu, IL-4 mengurangkan degradasi enzimatik tisu. In vivo, kesan terapeutik optimum dicapai dengan gabungan IL-4 dan IL-10. Faktor anabolik seperti TGF-β dan IGF-1 sebenarnya tidak mengganggu pengeluaran atau tindakan IL-1, tetapi mempamerkan aktiviti yang bertentangan, contohnya, merangsang sintesis proteoglycans dan kolagen, menekan aktiviti protease, dan TGF-β juga menghalang pembebasan enzim dan merangsang perencatnya.

Sitokin proinflamasi bertanggungjawab untuk peningkatan sintesis dan ekspresi MMP dalam tisu artikular. Mereka disintesis dalam membran sinovial dan kemudian meresap ke dalam rawan artikular melalui cecair sinovial. Sitokin proinflamasi mengaktifkan kondrosit, yang seterusnya juga mampu menghasilkan sitokin proinflamasi. Dalam sendi yang terjejas oleh osteoarthrosis, peranan efektor keradangan dimainkan terutamanya oleh sel-sel membran sinovial. Ia adalah sinovosit jenis makrofaj yang merembeskan protease dan mediator keradangan. Antaranya, IL-f, TNF-a, IL-6, faktor perencatan leukemia (LIF) dan IL-17 paling "terlibat" dalam patogenesis osteoarthrosis.

Bahan aktif secara biologi yang merangsang degradasi rawan artikular dalam osteoarthritis

• Interleukin-1
• Interleukin-3
• Interleukin-4
• TNF-a
• Faktor perangsang koloni: makrofaj (monosit) dan granulosit-makrofaj
• Bahan P
• PGE ₂
• Pengaktif plasminogen (jenis tisu dan urokinase) dan plasmin
• Metalloprotease (kolagenase, ellastase, stromelysins)
• Cathepsin A dan B
• Trilsin
• Lipopolisakarida bakteria
• Phospholipase Ag

Data kesusasteraan menunjukkan bahawa IL-1 dan, mungkin, TNF-a adalah mediator utama pemusnahan tisu sendi dalam osteoarthrosis. Walau bagaimanapun, masih tidak diketahui sama ada mereka bertindak secara bebas antara satu sama lain atau sama ada terdapat hierarki fungsian antara mereka. Model haiwan osteoarthrosis telah menunjukkan bahawa sekatan IL-1 berkesan menghalang pemusnahan rawan artikular, manakala sekatan TNF-a hanya membawa kepada penurunan keradangan pada tisu sendi. Peningkatan kepekatan kedua-dua sitokin didapati dalam membran sinovial, cecair sinovial, dan rawan pesakit. Dalam kondrosit, mereka dapat meningkatkan sintesis bukan sahaja protease (terutamanya MMP dan AP), tetapi juga kolagen kecil, seperti jenis I dan III, dan mengurangkan sintesis kolagen jenis II dan IX dan proteoglycans. Sitokin ini juga merangsang spesies oksigen reaktif dan mediator inflamasi seperti PGE ₂. Hasil daripada perubahan makromolekul sedemikian dalam rawan artikular dalam osteoarthritis adalah ketidakberkesanan proses reparatif, yang membawa kepada kemerosotan lebih lanjut rawan.

Sitokin proinflamasi yang disebutkan di atas memodulasi proses penindasan / pengaktifan MMP dalam osteoarthrosis. Sebagai contoh, ketidakseimbangan antara tahap TIMP-1 dan MMP dalam tulang rawan dalam osteoarthrosis mungkin dimediasi oleh IL-1, kerana kajian in vitro menunjukkan bahawa peningkatan dalam kepekatan beta IL-1 membawa kepada penurunan kepekatan TIMP-1 dan peningkatan dalam sintesis MMP oleh kondrosit. Sintesis AP juga dimodulasi oleh IL-1 beta. Rangsangan in vitro kondrosit rawan artikular dengan IL-1 menyebabkan peningkatan yang bergantung kepada dos dalam sintesis AP dan penurunan mendadak dalam sintesis iAP-1. Keupayaan IL-1 untuk mengurangkan sintesis iAP-1 dan merangsang sintesis AP adalah mekanisme yang kuat untuk penjanaan plasmin dan pengaktifan MMP. Di samping itu, plasmin bukan sahaja enzim yang mengaktifkan enzim lain, ia juga mengambil bahagian dalam proses degradasi rawan oleh proteolisis langsung.

IL-ip disintesis sebagai prekursor tidak aktif dengan jisim 31 kD (pra-IL-ip), dan kemudian, selepas pembelahan isyarat peptida, ditukar menjadi sitokin aktif dengan jisim 17.5 kD. Dalam tisu sendi, termasuk membran sinovial, cecair sinovial dan rawan artikular, IL-ip ditemui dalam bentuk aktif, dan kajian in vivo telah menunjukkan keupayaan membran sinovial dalam osteoarthrosis untuk merembeskan sitokin ini. Sesetengah protease serin mampu menukar pra-IL-ip kepada bentuk bioaktifnya. Dalam mamalia, sifat sedemikian ditemui hanya dalam satu protease, yang tergolong dalam keluarga enzim khusus aspartat sistein dan dipanggil enzim penukar IL-1β (ICF, atau caspase-1). Enzim ini mampu secara khusus menukar pra-IL-ip kepada IL-ip "matang" aktif secara biologi dengan jisim 17.5 kD. ICF ialah proenzim 45 kD (p45) yang disetempat dalam membran sel. Selepas pembelahan proteolitik proenzim p45, dua subunit yang dikenali sebagai p10 dan p20 terbentuk, yang dicirikan oleh aktiviti enzimatik.

TNF-a juga disintesis sebagai prekursor terikat membran dengan jisim 26 kDa; melalui pembelahan proteolitik ia dibebaskan daripada sel sebagai bentuk larut aktif dengan jisim 17 kDa. Pembelahan proteolitik dilakukan oleh enzim penukar TNF-a (TNF-AC), yang tergolong dalam keluarga adamalizin. AR Amin et al. (1997) mendapati peningkatan ekspresi mRNA TNF-AC dalam rawan artikular pesakit dengan osteoarthritis.

Pengaktifan biologi kondrosit dan sinovosit oleh IL-1 dan TNF-a dimediasi dengan mengikat kepada reseptor tertentu pada permukaan sel - IL-R dan TNF-R. Dua jenis reseptor telah dikenal pasti untuk setiap sitokin - IL-IP jenis I dan II dan TNF-R jenis I (p55) dan II (p75). IL-1PI dan p55 bertanggungjawab untuk penghantaran isyarat dalam sel tisu sendi. IL-1R jenis I mempunyai pertalian lebih tinggi sedikit untuk IL-1beta berbanding IL-1a; IL-1R jenis II, sebaliknya, mempunyai pertalian yang lebih tinggi untuk IL-1a berbanding IL- ip. Masih tidak jelas sama ada IL-IP jenis II boleh mengantara isyarat IL-1 atau ia hanya berfungsi untuk perencatan kompetitif persatuan IL-1 dengan IL-1R jenis I. Kondroitida dan fibroblas sinovial pesakit dengan osteoarthrosis mengandungi sejumlah besar IL-1PI dan p55, yang seterusnya menerangkan kepekaan tinggi sel-sel ini yang sepadan dengan sitokin. Proses ini membawa kepada peningkatan rembesan enzim proteolitik dan pemusnahan rawan artikular.

Penglibatan IL-6 dalam proses patologi dalam osteoarthritis tidak boleh diketepikan. Andaian ini berdasarkan pemerhatian berikut:

• IL-6 meningkatkan bilangan sel radang dalam membran sinovial,
• IL-6 merangsang percambahan kondrosit,
• IL-6 meningkatkan kesan IL-1 dalam meningkatkan sintesis MMP dan menghalang sintesis proteoglycan.

Walau bagaimanapun, IL-6 mampu mendorong pengeluaran TIMP, tetapi tidak menjejaskan pengeluaran MMP, jadi dipercayai bahawa sitokin ini terlibat dalam proses menghalang degradasi proteolitik rawan artikular, yang dijalankan oleh mekanisme maklum balas.

Satu lagi ahli keluarga IL-6 ialah LIF, sitokin yang dihasilkan oleh kondrosit yang diperoleh daripada pesakit dengan osteoarthrosis sebagai tindak balas kepada rangsangan oleh sitokin proinflamasi IL-1p dan TNF-a. LIF merangsang penyerapan proteoglycan rawan, serta sintesis MMP dan pengeluaran NO. Peranan sitokin ini dalam osteoarthrosis belum dijelaskan sepenuhnya.

IL-17 ialah homodimer 20-30 kD dengan kesan seperti IL-1, tetapi kurang ketara. IL-17 merangsang sintesis dan pembebasan beberapa sitokin proinflamasi, termasuk IL-1p, TNF-a, IL-6, dan MMP dalam sel sasaran, seperti makrofaj manusia. Di samping itu, IL-17 merangsang pengeluaran NO oleh kondrosit. Seperti LIF, peranan IL-17 dalam patogenesis OA telah kurang dikaji.

NO radikal bebas bukan organik memainkan peranan penting dalam degradasi rawan artikular dalam OA. Kondrosit yang diasingkan daripada pesakit dengan osteoarthritis menghasilkan jumlah NO yang lebih tinggi secara spontan dan selepas rangsangan dengan sitokin proinflamasi berbanding dengan sel normal. Kandungan NO yang tinggi telah ditemui dalam cecair sinovial dan serum pesakit osteoarthritis - ini adalah hasil daripada peningkatan ekspresi dan sintesis NO synthase (hNOC), enzim yang bertanggungjawab untuk pengeluaran NO. Baru-baru ini, DNA hNOC khusus chondrocyte telah diklon, dan urutan asid amino enzim telah ditentukan. Urutan asid amino menunjukkan 50% identiti dan 70% persamaan dengan hNOC khusus untuk endothelium dan tisu saraf.

NO menghalang sintesis makromolekul ECM rawan artikular dan merangsang sintesis MMP. Selain itu, peningkatan dalam pengeluaran NO disertai dengan penurunan dalam sintesis antagonis IL-IP (IL-1RA) oleh kondrosit. Oleh itu, peningkatan tahap IL-1 dan penurunan IL-1RA membawa kepada hiperstimulasi NO dalam kondrosit, yang seterusnya membawa kepada peningkatan degradasi matriks rawan. Terdapat laporan mengenai kesan terapeutik dalam vivo perencat hNOC terpilih pada perkembangan osteoarthrosis eksperimen.

Inhibitor sitokin semulajadi dapat secara langsung menghalang sitokin daripada mengikat reseptor membran sel, mengurangkan aktiviti proinflamasinya. Inhibitor sitokin semulajadi boleh dibahagikan kepada tiga kelas berdasarkan cara tindakannya.

Kelas pertama perencat termasuk antagonis reseptor yang menghalang pengikatan ligan kepada reseptornya dengan bersaing untuk tapak pengikatan. Sehingga kini, perencat sedemikian hanya ditemui untuk IL-1 - ini adalah perencat kompetitif yang disebutkan di atas bagi sistem IL-1/ILIP IL-1 PA. IL-1 PA menyekat banyak kesan yang diperhatikan dalam tisu sendi dalam osteoarthritis, termasuk sintesis prostaglandin oleh sel sinovial, pengeluaran kolagenase oleh kondrosit, dan degradasi BM rawan artikular.

IL-1RA didapati dalam bentuk yang berbeza - satu larut (rIL-1RA) dan dua antara sel (μIL-lPAI dan μIL-1RAP). Perkaitan bentuk terlarut IL-1RA adalah 5 kali lebih tinggi daripada bentuk antara sel. Walaupun penyelidikan saintifik intensif, fungsi yang terakhir masih tidak diketahui. Eksperimen in vitro telah menunjukkan bahawa perencatan aktiviti IL-1beta memerlukan kepekatan IL-1RA 10-100 kali lebih tinggi daripada biasa, manakala dalam keadaan vivo memerlukan peningkatan seribu kali ganda dalam kepekatan IL-1RA. Fakta ini mungkin sebahagiannya menjelaskan kekurangan relatif IL-1RA dan lebihan IL-1 dalam sinovium pesakit dengan osteoarthrosis.

Kelas kedua perencat sitokin semulajadi ialah reseptor sitokin larut. Contoh perencat tersebut pada manusia yang berkaitan dengan patogenesis osteoarthritis ialah rIL-1R dan pp55. Reseptor sitokin larut ialah bentuk reseptor normal yang dipendekkan; apabila mereka mengikat kepada sitokin, mereka menghalang pengikatannya kepada reseptor sel sasaran yang berkaitan dengan membran, bertindak melalui mekanisme antagonisme kompetitif.

Prekursor utama reseptor larut ialah IL-1RP yang terikat membran. Perkaitan rIL-IP untuk IL-1 dan IL-1RA adalah berbeza. Oleh itu, rIL-1RN mempunyai pertalian yang lebih tinggi untuk IL-1β berbanding IL-1RA, dan rIL-1PI mempamerkan pertalian yang lebih tinggi untuk IL-1RA berbanding IL-ip.

Terdapat juga dua jenis reseptor larut untuk TNF - pp55 dan pp75, seperti reseptor IL-1 larut, ia dibentuk dengan "penumpahan". Dalam vivo, kedua-dua reseptor ditemui dalam tisu sendi terjejas. Peranan reseptor TNF larut dalam patogenesis osteoarthrosis diperdebatkan. Diandaikan bahawa dalam kepekatan rendah mereka menstabilkan struktur tiga dimensi TNF dan meningkatkan separuh hayat sitokin bioaktif, manakala kepekatan tinggi pp55 dan pp75 boleh mengurangkan aktiviti TNF dengan antagonisme kompetitif. Mungkin, pp75 boleh bertindak sebagai pembawa TNF, memudahkan pengikatannya kepada reseptor yang berkaitan dengan membran.

Kelas ketiga perencat sitokin semulajadi diwakili oleh sekumpulan sitokin anti-radang, yang termasuk TGF-beta, IL-4, IL-10 dan IL-13. Sitokin anti-radang mengurangkan pengeluaran pro-radang dan beberapa protease, dan merangsang pengeluaran IL-1RA dan TIMP.