Fact-checked
х

Semua kandungan iLive disemak secara perubatan atau fakta diperiksa untuk memastikan ketepatan faktual sebanyak mungkin.

Kami mempunyai garis panduan sumber yang ketat dan hanya memautkan ke tapak media yang bereputasi, institusi penyelidikan akademik dan, apabila mungkin, dikaji semula kajian secara medis. Perhatikan bahawa nombor dalam kurungan ([1], [2], dan lain-lain) boleh diklik pautan ke kajian ini.

Jika anda merasakan bahawa mana-mana kandungan kami tidak tepat, ketinggalan zaman, atau tidak dipersoalkan, sila pilih dan tekan Ctrl + Enter.

Diagnosis makmal tuberkulosis

Pakar perubatan artikel itu

Pakar dalaman, pakar penyakit berjangkit
, Editor perubatan
Ulasan terakhir: 05.07.2025

Tuberkulosis adalah penyakit yang mudah didiagnosis dalam keadaan moden dan pencapaian saintifik. Diagnostik makmal tuberkulosis menduduki tempat utama antara kaedah diagnostik lain, kedua selepas kaedah pemeriksaan sinar-X.

trusted-source[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Ujian darah klinikal

Pada pesakit dengan tuberkulosis, perubahan dalam ujian darah am tidak patognomonik. Dalam bentuk tuberkulosis yang terhad dan rendah aktif, hipokromia eritrosit dengan bilangan normal adalah ciri. Dalam penyusupan besar-besaran atau pneumonia caseous, dengan limfadenitis caseous yang meluas, kerosakan usus tertentu, serta dengan pendarahan pulmonari atau pasca operasi yang besar, erythropenia dan microcytosis, oligochromasia, polikromasia dicatatkan. Makrositosis, dan terutamanya poikilositosis, ditemui lebih jarang, biasanya dengan anemia yang teruk. Bilangan retikulosit dalam peringkat tuberkulosis pampasan berbeza dari 0.1 hingga 0.6%, dalam peringkat subcompensated - dari 0.6 hingga 1.0%, dan untuk peringkat decompensated, 1% daripada retikulosit adalah ciri.

Dalam beberapa kes tuberkulosis, leukositosis sederhana (sehingga 15 ribu leukosit) boleh diperhatikan, kurang kerap leukopenia, yang berlaku dalam 2-7% kes pada pesakit dengan bentuk proses yang terhad dan ringan dan dalam 12.5% dalam tuberkulosis pulmonari yang merosakkan dan progresif.

Selalunya, perubahan berlaku dalam formula leukosit. Kedua-dua neutrophilia relatif dan mutlak dicatatkan, peralihan sederhana dalam formula leukosit ke kiri ke promyelocytes. Myelocytes sangat jarang ditemui dalam kes tuberkulosis yang tidak rumit. Peningkatan bilangan neutrofil dengan butiran patologi dalam hemogram pesakit dengan tuberkulosis sentiasa menunjukkan tempoh proses: pada pesakit dengan tuberkulosis yang teruk, hampir semua neutrofil mengandungi butiran patologi. Apabila wabak tuberkulosis reda, anjakan nuklear kembali normal dengan cepat. Butiran patologi neutrofil biasanya berterusan lebih lama daripada perubahan lain dalam hemogram.

Kandungan eosinofil dalam darah periferal juga berubah-ubah bergantung pada fasa proses dan keadaan alahan organisma. Bilangan mereka berkurangan kepada aneosinofilia dalam wabak penyakit yang teruk dan berlarutan dan, sebaliknya, meningkat semasa penyerapan infiltrat dan efusi pleura, serta dalam bentuk awal tuberkulosis primer.

Kebanyakan bentuk tuberkulosis primer disertai oleh limfopenia, yang kadang-kadang diperhatikan selama beberapa tahun walaupun selepas parut perubahan tertentu. Tuberkulosis sekunder dalam fasa akut, bergantung kepada keparahan proses, boleh disertai sama ada bilangan limfosit atau limfopenia yang normal.

Antara ujian untuk menilai proses tuberkulosis, tempat khas diduduki dengan menentukan kadar pemendapan eritrosit (ESR), yang penting dalam menilai perjalanan proses tuberkulosis dan mengenal pasti bentuk aktifnya. Peningkatan ESR menunjukkan kehadiran proses patologi (berjangkit dan keradangan, purulen, septik, hemoblastosis, limfogranulomatosis, dll.) Dan berfungsi sebagai penunjuk keparahannya, tetapi nilai ESR normal tidak selalu menunjukkan ketiadaan patologi. Pecutan pemendapan eritrosit difasilitasi oleh peningkatan kandungan globulin, fibrinogen, kolesterol dalam darah dan penurunan kelikatan darah. Melambatkan pemendapan eritrosit adalah ciri keadaan yang disertai oleh hemoconcentration, peningkatan kandungan albumin dan asid hempedu.

Hemogram pesakit tuberkulosis berubah semasa rawatan. Lebih berjaya campur tangan terapeutik, lebih cepat perubahan hematologi hilang. Pada masa yang sama, kesan pelbagai ubat antibakteria pada hematopoiesis harus diingat. Mereka sering menyebabkan eosinofilia, dalam beberapa kes - leukositosis, dan lebih kerap leukopenia sehingga agranulositosis dan tindak balas limfoid-retikular. Pemantauan hematologi yang sistematik dan analisis yang betul terhadap data yang diperolehi adalah penting untuk menilai keadaan klinikal pesakit, dinamik proses dan keberkesanan rawatan.

trusted-source[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Analisis air kencing klinikal

Dalam kes tuberkulosis saluran kencing, analisis air kencing adalah kaedah diagnostik makmal utama. Leukocyturia, erythrocyturia, proteinuria, hypoisosthenuria, mycobacteriuria tuberkulosis, bacteriuria tidak spesifik boleh diperhatikan.

Leukocyturia adalah simptom tuberkulosis saluran kencing yang paling biasa sebelum kemoterapi khusus dan tidak hadir hanya dalam kes luar biasa, seperti pemusnahan lengkap lumen ureter. Ujian Nechiporenko (penentuan bilangan leukosit dalam 1 ml air kencing) membantu menilai secara lebih objektif tahap leukocyturia dalam nefrotuberkulosis, dan dalam beberapa kes untuk mengesannya dengan analisis air kencing umum yang normal. Walau bagaimanapun, perlu diambil kira bahawa leukocyturia boleh berlaku dalam pyelonephritis akut dan kronik, cystitis, uretritis, batu karang dan ureter.

Erythrocyturia, seperti leukocyturia, dianggap sebagai salah satu tanda makmal tuberkulosis genitouriner yang paling biasa. Kekerapan hematuria bergantung pada kelaziman proses; ia meningkat apabila proses tuberkulosis yang merosakkan dalam buah pinggang berkembang. Erythrocyturia tanpa leukocyturia adalah lebih tipikal untuk peringkat awal tuberkulosis buah pinggang. Hematuria, mengatasi leukocyturia, adalah hujah penting yang memihak kepada tuberkulosis buah pinggang apabila membezakannya daripada pyelonephritis tidak spesifik.

trusted-source[ 10 ], [ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Ujian darah biokimia

Dalam tuberkulosis, perubahan dalam beberapa indeks biokimia bergantung terutamanya pada fasa proses, komplikasi dan pelbagai penyakit bersamaan. Pada pesakit dengan tuberkulosis paru-paru dan organ lain yang tidak aktif, jumlah pecahan protein dan protein serum darah tidak berubah dan menentukan kandungan normalnya.

Dalam bentuk akut penyakit, serta dalam pemburukan dan perkembangan bentuk kronik tuberkulosis, pekali albumin-globulin berkurangan.

Kepentingan penting dalam menilai keadaan fungsi dan kerosakan organik pada hati dalam tuberkulosis dan komplikasinya ialah penentuan bilirubin langsung dan jumlah, aspartat aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT) dalam serum darah. Penentuan dinamik tahap aminotransferase. bilirubin dalam rawatan pesakit tuberkulosis, terutamanya dalam bentuk yang teruk, adalah komponen wajib pemeriksaan biokimia pesakit dengan tuberkulosis dan dijalankan setiap bulan.

Penilaian keadaan fungsi buah pinggang termasuk penentuan kreatinin serum dan pengiraan kadar penapisan glomerular menggunakan formula Cockcroft-Gault. Pengiraan kadar penapisan glomerular menggunakan ujian Reberg memberikan keputusan yang kurang tepat.

Matlamat utama kajian biokimia dinamik pesakit dengan tuberkulosis adalah untuk memantau perjalanan proses, pengesanan kesan sampingan ubat yang tepat pada masanya dan pembetulan yang mencukupi bagi gangguan homeostasis yang muncul.

trusted-source[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Aplikasi kaedah penyelidikan biokimia dalam tuberkulosis ekstrapulmonari

Penunjuk yang paling bermaklumat dianggap sebagai kandungan asid tuberkulostearik dalam cecair biologi, bagaimanapun, penentuannya dikaitkan dengan kesukaran teknikal (keperluan untuk menggunakan kromatografi gas dan spektrometri jisim).

Ia menjanjikan untuk mengukur aktiviti adenosin deaminase - enzim yang ditentukan dalam cecair: sinovial, perikardial, ascitic atau serebrospinal. Pengeluar utama adenosin deaminase adalah limfosit dan monosit. Penentuan aktiviti adenosin deaminase dalam cecair biologi memudahkan diagnosis sinovitis tuberkulosis, tuberkulosis nodus limfa, meningitis tuberkulosis, serositis tuberkulosis.

Sesetengah penunjuk biokimia, kerana bukan kekhususannya, hanya ditentukan dalam cecair biologi berhampiran dengan lesi. Tahap penunjuk diukur sebagai tindak balas kepada pentadbiran subkutaneus atau intradermal tuberculin (biasanya sebelum pentadbiran dan 48 dan 72 jam selepas itu). Selepas ini, tahap peningkatan tahap penanda (dalam %) dikira berhubung dengan tahap awal.

Secara optimum, aktiviti enzim transamidinase khusus organ ditentukan dalam air kencing; penampilannya dicatatkan dalam kerosakan buah pinggang dari pelbagai asal. Kajian transamidinase hanya dibenarkan dalam keadaan pentadbiran subkutaneus tuberculin untuk memburukkan lagi proses keradangan tempatan. Aktiviti transamidinase ditentukan dalam air kencing pada mulanya dan 24-72 jam selepas pentadbiran 50 TE tuberculin. Peningkatan fermenturia sebanyak 2 kali atau lebih membolehkan dalam 82% kes membezakan tuberkulosis buah pinggang aktif daripada pemburukan pyelonephritis kronik.

Dalam kes tuberkulosis organ kemaluan wanita, kepekatan haptoglobin dan malondialdehid dalam darah ditentukan di bawah syarat ujian tuberkulin provokatif. Tuberculin ditadbir secara subkutan pada dos 50 TE dan kajian biokimia ulangan dilakukan selepas 72 jam. Dalam kes etiologi tuberkulosis, tahap peningkatan tahap haptoglobin adalah sekurang-kurangnya 28%, dan tahap malondialdehid adalah 39% atau lebih. Penentuan aktiviti adenosin deaminase dalam cecair peritoneal yang diperoleh daripada kantung Douglas juga digunakan. Tusukan diperiksa semula 72 jam selepas pentadbiran intradermal tuberculin pada dos 0.1 TE dan 0.01 TE di kawasan unjuran organ genital dalaman pada dinding abdomen anterior. Peningkatan dalam aktiviti adenosin deaminase sebanyak 10% atau lebih berbanding dengan nilai awal menunjukkan proses tuberkulosis.

Dalam kes kerosakan mata, tindak balas fokus yang berlaku dalam mata sebagai tindak balas kepada rangsangan antigen diperiksa. Dalam kes ini, perkembangan tindak balas yang dinyatakan secara mendadak disertai dengan penurunan dalam fungsi visual adalah tidak diingini. Memandangkan penilaian tindak balas fokus minimum selalunya sukar, adalah disyorkan untuk memberi tumpuan selari pada tahap peningkatan haptoglobin atau adenosin deaminase dalam serum darah untuk menentukan kesimpulannya.

Semua kajian biokimia harus dijalankan dalam kombinasi dengan kaedah lain.

trusted-source[ 20 ], [ 21 ], [ 22 ], [ 23 ]

Kajian sistem pembekuan darah

Perkaitan mengkaji keadaan sistem pembekuan darah dalam phthisiology adalah disebabkan oleh kehadiran hemoptisis atau pendarahan paru-paru dalam beberapa pesakit dengan tuberkulosis paru-paru, serta komplikasi hemokoagulasi dalam rawatan pembedahan tuberkulosis. Di samping itu, hemokoagulasi intravaskular terpendam secara semula jadi mempengaruhi perjalanan penyakit dan keberkesanan kemoterapi.

Pada pesakit dengan tuberkulosis pulmonari dengan komponen eksudatif utama keradangan, penurunan dalam aktiviti antikoagulan darah diperhatikan. Pada pesakit dengan kelaziman rendah kerosakan paru-paru tertentu dengan komponen keradangan produktif yang dominan, hemokoagulasi intravaskular dinyatakan secara tidak ketara. Pada pesakit dengan tuberkulosis pulmonari dengan hemoptisis dan pendarahan paru-paru, keadaan sistem pembekuan darah adalah berbeza: pada pesakit dengan kehilangan darah kecil pada ketinggian hemoptoea atau sejurus selepas pemberhentiannya, peningkatan mendadak dalam kapasiti pembekuan darah diperhatikan disebabkan oleh peningkatan ketara proses pembentukan trombin sambil mengekalkan peningkatan "struktur" yang meningkat. Pada pesakit dengan kehilangan darah yang besar, penurunan potensi pembekuan diperhatikan disebabkan oleh penurunan kepekatan fibrinogen, aktiviti faktor XIII, dan kiraan platelet. Pada peringkat rawatan pembedahan pada pesakit dengan bentuk tuberkulosis pulmonari yang terhad, gangguan yang ketara dalam sistem homeostasis tidak berlaku. Pada pesakit dengan proses yang meluas, apabila melakukan pneumonectomy atau pleuropneumonectomy, sindrom DIC sering berkembang, yang boleh mengambil bentuk "penyakit kedua".

Untuk memantau keadaan sistem pembekuan darah pada pesakit dengan tuberkulosis pulmonari, adalah perlu untuk menentukan masa tromboplastin separa diaktifkan (APTT), fibrinogen, masa trombin, indeks prothrombin, serta masa pendarahan dan masa pembekuan darah.

trusted-source[ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ], [ 28 ]

Kajian hormon

Pemerhatian eksperimen dan klinikal moden menunjukkan kehadiran perubahan dalam status hormon dalam keradangan tuberkulosis tertentu paru-paru. Telah terbukti bahawa pembetulan disfungsi sistem pituitari-adrenal, pituitari-tiroid dan fungsi pankreas dalam kombinasi dengan terapi anti-tuberkulosis menyumbang kepada pengaktifan fibrogenesis dan proses pembaikan dalam fokus keradangan tertentu.

Keadaan fungsi sistem pituitari-tiroid dinilai oleh kandungan triiodothyronine (T3), tiroksin (T4), dan hormon perangsang tiroid pituitari (TSH) dalam serum darah . Telah ditetapkan bahawa hipotiroidisme subklinikal dikesan dalam 38-45% pesakit dengan tuberkulosis pulmonari, dan ia paling kerap didiagnosis dalam bentuk proses yang tersebar dan berserabut-cavernous. Dalam bentuk ini, tahap kedua-dua T3 dan T4 dikurangkan dengan paling ketara , dan ketidakseimbangan hormon ini berlaku dalam bentuk peningkatan dalam nisbah T4/ T3.

Fungsi korteks adrenal dinilai oleh tahap kortisol serum, dan fungsi endokrin pankreas dinilai oleh kepekatan insulin imunoreaktif. Dalam fasa akut penyakit berjangkit, keperluan untuk kortisol endogen dan insulin meningkat. Hiperinsulinemia juga menunjukkan rintangan insulin pada tisu badan, yang tipikal untuk sebarang proses keradangan aktif, khususnya yang khusus. Penentuan fungsi glukokortikoid kelenjar adrenal dalam tuberkulosis pulmonari aktif membolehkan kita mengesan kehadiran hypercorticism pada kebanyakan pesakit. Kepekatan kortisol darah normal pada pesakit dengan keradangan berjangkit dalam tempoh akut harus dianggap sebagai kekurangan relatif fungsi glukokortikoid korteks adrenal, yang boleh berfungsi sebagai asas untuk terapi penggantian dengan dos glukokortikoid yang mencukupi.

Hampir satu pertiga daripada pesakit dengan tuberkulosis pulmonari mempunyai tahap insulinemia yang rendah menghampiri had bawah norma, manakala 13-20% mempunyai hiperinsulinisme yang ketara. Kedua-dua hipo- dan hiperinsulinisme relatif adalah faktor risiko tinggi untuk perkembangan gangguan metabolisme karbohidrat dengan keparahan yang berbeza-beza. Perubahan dalam aktiviti fungsi sel B pankreas memerlukan pemantauan glikemia yang kerap pada pesakit dengan batuk kering dan pencegahan diabetes mellitus yang tepat pada masanya. Di samping itu, ini berfungsi sebagai justifikasi tambahan untuk kesesuaian penggunaan dos fisiologi insulin dalam terapi kompleks tuberkulosis.

Secara umum, penurunan tahap hormon tiroid, ketidakseimbangannya, hiperkortisolea dan hiperinsulinisme paling ketara pada pesakit yang mengalami proses tuberkulosis yang teruk, dengan lesi paru-paru yang meluas dan gejala mabuk tuberkulosis yang ketara.

Diagnostik mikrobiologi tuberkulosis

Kajian mikrobiologi adalah perlu untuk mengenal pasti pesakit tuberkulosis, mengesahkan diagnosis, memantau dan membetulkan kemoterapi, menilai hasil rawatan, dengan kata lain, dari saat pesakit tuberkulosis didaftarkan sehingga dia dikeluarkan dari daftar.

Semua program dan projek epidemiologi adalah berdasarkan penilaian bilangan perkumuhan bakteria, yang mustahil dilakukan tanpa menggunakan kaedah makmal untuk mengesan mikobakteria tuberkulosis. Apabila meneliti daya tarikan penduduk yang dipanggil tidak teratur, peratusan perkumuhan bakteria mencapai 70 atau lebih, yang menjadikan kaedah makmal sebagai cara yang agak berkesan untuk mengenal pasti pesakit tuberkulosis di kalangan kumpulan populasi ini.

Kaedah mikrobiologi tradisional untuk mendiagnosis tuberkulosis adalah kajian bakterioskopi dan budaya. Kaedah moden termasuk membiakkan mikobakteria tuberkulosis dalam sistem automatik dan PCR. Walau bagaimanapun, semua kaedah ini semestinya digabungkan dengan kaedah bakteriologi klasik.

Pengumpulan bahan diagnostik

Keberkesanan ujian makmal sebahagian besarnya bergantung pada kualiti bahan diagnostik. Pematuhan dengan peraturan untuk mengumpul, menyimpan dan mengangkut bahan diagnostik dan pelaksanaan tepat algoritma pemeriksaan pesakit secara langsung mempengaruhi keputusan dan memastikan keselamatan biologi.

Pelbagai bahan digunakan untuk menguji tuberkulosis. Oleh kerana batuk kering pulmonari adalah bentuk jangkitan tuberkulosis yang paling biasa, bahan utama untuk ujian dianggap sebagai kahak dan jenis pelepasan pokok trakeobronkial lain: pelepasan saluran pernafasan atas yang diperoleh selepas penyedutan aerosol: air lavage bronkial; lavages bronchoalveolar; bahan yang diperoleh semasa bronkoskopi, biopsi transtrakeal dan intrapulmonari: aspirasi bronkial, smear laring, eksudat, smear luka, dsb.

Keberkesanan penyelidikan meningkat jika pengumpulan bahan terkawal daripada pesakit dijalankan. Untuk tujuan ini, bilik yang dilengkapi khas diperuntukkan atau gerai khas dibeli. Pengumpulan bahan adalah prosedur yang berbahaya, oleh itu, bahan untuk penyelidikan mesti dikumpul dengan mematuhi peraturan keselamatan jangkitan.

Bahan untuk ujian Mycobacterium tuberculosis dikumpul dalam botol steril dengan penutup diskru ketat untuk mengelakkan pencemaran alam sekitar dan melindungi bahan yang dikumpul daripada pencemaran.

Vial untuk mengumpul bahan diagnostik mesti memenuhi keperluan berikut:

  • mesti diperbuat daripada bahan tahan hentaman;
  • hendaklah mudah cair apabila diautoklaf;
  • mempunyai isipadu yang mencukupi (40-50 ml):
  • mempunyai bukaan lebar untuk mengumpul dahak (diameter tidak kurang daripada 30 mm);
  • mudah dikendalikan, telus atau lut sinar, supaya kuantiti dan kualiti sampel yang dikumpul boleh dinilai tanpa membuka penutup.

Untuk mendapatkan hasil penyelidikan yang optimum, syarat-syarat berikut mesti dipenuhi:

  • pengumpulan bahan perlu dijalankan sebelum permulaan kemoterapi;
  • bahan untuk kajian mesti dikumpulkan sebelum makan atau mengambil ubat pada waktu pagi;
  • Untuk kajian, adalah dinasihatkan untuk mengumpul sekurang-kurangnya 3 sampel kahak pagi. Sputum dikumpul selama 3 hari berturut-turut;
  • Bahan yang dikumpul mesti dihantar ke makmal secepat mungkin:
  • dalam kes di mana tidak mustahil untuk menghantar bahan ke makmal dengan segera, ia disimpan di dalam peti sejuk pada suhu udara 4 °C selama tidak lebih daripada 48 jam;
  • Apabila mengangkut bahan, perlu memberi perhatian khusus kepada integriti botol.

Sputum yang terkumpul dengan betul mempunyai ciri lendir atau mukopurulen. Jumlah optimum bahagian sputum yang diperiksa ialah 3-5 ml.

Kahak dikumpul di bawah pengawasan seorang pekerja kesihatan. Orang yang bertanggungjawab untuk mengumpul dahak mesti memastikan bahawa peraturan tertentu dipatuhi:

  • Ia adalah perlu untuk menjelaskan kepada pesakit tujuan pemeriksaan dan keperluan untuk batuk bukan air liur atau lendir nasofaring, tetapi kandungan bahagian dalam saluran pernafasan. Ini boleh dicapai akibat batuk produktif yang berlaku selepas beberapa (2-3) nafas dalam. Ia juga perlu untuk memberi amaran kepada pesakit bahawa dia mesti terlebih dahulu membilas mulutnya dengan air masak untuk mengeluarkan bahagian utama mikroflora tumbuh-tumbuhan dalam rongga mulut dan serpihan makanan yang merumitkan pemeriksaan dahak;
  • Pekerja perubatan yang terlibat dalam mengumpul kahak, sebagai tambahan kepada gaun dan topi, mesti memakai topeng, sarung tangan getah dan apron getah;
  • berdiri di belakang pesakit, dia dinasihatkan untuk memegang botol itu sedekat mungkin dengan bibirnya dan segera asingkan kahak ke dalamnya semasa dia batuk, sementara ia adalah perlu untuk memastikan aliran udara diarahkan dari pekerja kesihatan:
  • Setelah pengumpulan kahak selesai, pekerja kesihatan hendaklah menutup botol dengan penutup dengan teliti dan menilai kuantiti dan kualiti kahak yang dikumpul. Botol itu kemudiannya dilabel dan diletakkan di dalam kotak khas untuk pengangkutan ke makmal.

Sekiranya pesakit tidak mengeluarkan dahak, maka pada malam sebelum dan awal pagi pada hari pengumpulan bahan, dia harus diberi ekspektoran: ekstrak akar marshmallow (mucaltin), bromhexine, ambroxol, dll - atau penyedutan yang menjengkelkan harus digunakan, menggunakan peralatan yang dipasang di dalam bilik untuk mengumpul dahak. Bahan yang dikumpul dengan cara ini tidak tertakluk kepada pemeliharaan dan harus diperiksa pada hari pengumpulan. Untuk mengelakkan "penolakan" di makmal, nota khas perlu dibuat dalam rujukan.

Jika kajian mikrobiologi tidak dilakukan di institusi tertentu, bahan diagnostik yang dikumpul mesti dihantar ke makmal secara berpusat, dengan syarat bahan itu disimpan di dalam peti sejuk atau dengan bahan pengawet antara penghantaran. Bahan dihantar ke makmal dalam kotak pengangkutan yang mudah dinyahjangkit. Setiap sampel mesti dibekalkan dengan label yang sesuai, dan keseluruhan kumpulan mesti mempunyai borang yang disertakan dengan lengkap.

trusted-source[ 29 ], [ 30 ], [ 31 ]

Mod dan kekerapan pemeriksaan pesakit

Semasa pemeriksaan awal, yang dipanggil diagnostik, pesakit untuk tuberkulosis, adalah perlu untuk memeriksa sekurang-kurangnya 3 bahagian sputum yang dikumpulkan di bawah pengawasan kakitangan perubatan selama 2 atau 3 hari, yang meningkatkan keberkesanan mikroskop.

Pemeriksaan primer untuk tuberkulosis hendaklah dijalankan oleh semua institusi perubatan dan diagnostik sistem penjagaan kesihatan. Baru-baru ini, untuk meningkatkan keberkesanan pemeriksaan primer, pusat mikroskopi yang dipanggil telah dianjurkan berdasarkan makmal diagnostik klinikal, dilengkapi dengan mikroskop dan peralatan moden untuk memastikan keselamatan wabak.

Institusi anti-tuberkulosis menggunakan skim tinjauan yang menyediakan sekurang-kurangnya 3 kali pemeriksaan sputum atau bahan diagnostik lain dalam masa 3 hari. Semasa rawatan, kajian mikrobiologi dijalankan secara berkala sekurang-kurangnya sekali sebulan dalam fasa kemoterapi intensif. Apabila berpindah ke fasa susulan, kajian dijalankan kurang kerap - pada selang 2-3 bulan, manakala kekerapan kajian dikurangkan kepada dua.

Ciri-ciri mengumpul bahan diagnostik untuk tuberkulosis ekstrapulmonari

Ciri bahan patologi dalam bentuk extrapulmonary tuberkulosis adalah kepekatan rendah mycobacteria tuberculosis di dalamnya, yang memerlukan kaedah penyelidikan mikrobiologi yang lebih sensitif, terutamanya kaedah menyemai pada medium nutrien.

Dalam kes tuberkulosis genitouriner, air kencing adalah bahan yang paling mudah diakses untuk pemeriksaan. Pengumpulan air kencing hendaklah dilakukan oleh jururawat terlatih khas.

Alat kelamin luar dibasuh dengan air dan sabun atau larutan kalium permanganat yang lemah. Pembukaan luar uretra dirawat dengan teliti. Bahagian tengah air kencing pagi dikumpulkan dalam botol steril: pada lelaki - secara semula jadi, pada wanita - menggunakan kateter. Air kencing dari pelvis buah pinggang dikumpulkan dalam tiub ujian steril semasa kateterisasi satu atau dua buah pinggang, dalam kes kedua - semestinya secara berasingan dari setiap buah pinggang. Sebilangan kecil air kencing ini disentrifugasi, sedimen diperiksa.

Pada lelaki, sperma, tusukan testis, dan rembesan prostat disentrifugasi untuk mendapatkan sedimen. Dengan sebarang penyetempatan proses tertentu di kawasan alat kelamin pada lelaki, urutan prostat boleh menggalakkan pembebasan rembesan yang mengandungi mikobakteria tuberkulosis.

Darah haid diambil daripada wanita melalui sedutan atau menggunakan penutup Kafka. Bahan yang terhasil dibebaskan daripada eritrosit dengan membasuhnya dengan air suling dan kemudian mengempar. Sedimen diperiksa.

Pelepasan dari saluran serviks rahim dikumpulkan dalam beberapa bekas atau topi Kafka, iaitu, adalah wajar untuk mengumpul 1-2 ml bahan patologi.

Bahan yang diperoleh semasa campur tangan pembedahan pada buah pinggang, alat kelamin, biopsi, pengikisan endometrium, dihomogenkan. Untuk melakukan ini, ia diletakkan dalam mortar steril dan dihancurkan dengan teliti dengan gunting steril. Pasir sungai yang steril ditambah kepada penggantungan yang terhasil dalam jumlah yang sama dengan jisimnya, kemudian 0.5-1.0 ml larutan natrium klorida isotonik ditambah dan semuanya dikisar sehingga jisim lembek terbentuk dengan penambahan larutan natrium klorida isotonik (4-5 ml). Kemudian jisim dibenarkan untuk menetap selama 1-1.5 minit, supernatan diperiksa.

Tuberkulosis tulang dan sendi. Tusukan (nanah dari abses) yang diperolehi dengan picagari steril diletakkan di dalam bekas steril dan segera dihantar ke makmal. Menggunakan pipet steril, sebelum ini dibasahkan dengan larutan natrium klorida isotonik steril, 2-5 ml nanah diambil, dipindahkan ke botol dengan manik dan 2-3 ml larutan natrium klorida isotonik lagi ditambah. Botol ditutup dengan penyumbat dan digoncang dalam shaker selama 8-10 minit. Suspensi homogen diperiksa.

Dalam bentuk fistulous tuberkulosis osteoartikular, nanah diambil dari fistula. Pelepasan yang banyak dikumpul terus ke dalam tabung uji. Dalam kes pelepasan nanah yang sedikit, saluran fistula dibasuh dengan larutan natrium klorida isotonik steril, dan basuhan yang dikumpul dalam tabung uji atau sekeping tampon yang direndam dalam nanah dihantar untuk pemeriksaan.

Bahan pembedahan yang diperolehi semasa campur tangan pembedahan pada tulang dan sendi mungkin terdiri daripada jisim purulen-nekrotik, granulasi, tisu parut, tisu tulang, tisu membran sinovial dan substrat lain. Pemprosesannya dilakukan seperti dalam kes tuberkulosis buah pinggang.

Pemeriksaan mikrobiologi cecair sinovial dalam larutan natrium sitrat 3% (dalam nisbah 1:1) untuk mengelakkan pembekuan dilakukan serta-merta selepas tusukan.

Tuberkulosis nodus limfa. Nanah yang diekstrak semasa tusukan nodus limfa diperiksa dengan cara yang sama seperti nanah dari abses. Tisu nodus limfa yang diperoleh semasa campur tangan pembedahan dan biopsi diperiksa seperti dalam bentuk tuberkulosis yang lain.

Kajian najis untuk Mycobacterium tuberculosis dilakukan sangat jarang kerana ketiadaan hasil positif yang hampir lengkap.

trusted-source[ 32 ], [ 33 ], [ 34 ], [ 35 ], [ 36 ]

Mikroskopi mikobakteria

Mikroskopi sputum adalah kaedah yang agak cepat, mudah dan murah yang harus digunakan dalam semua kes di mana tuberkulosis disyaki. Di samping itu, kajian ini dilakukan untuk menilai keberkesanan kemoterapi dan untuk mengesahkan pemulihan atau kegagalan rawatan jika tiada hasil kultur.

Dua kaedah pemeriksaan mikroskopik digunakan:

  • kaedah mikroskop langsung, apabila smear disediakan terus daripada bahan diagnostik;
  • kaedah mikroskopi sedimen yang disediakan daripada bahan yang dirawat dengan dekontaminasi untuk penyelidikan budaya.

Kaedah pertama digunakan di makmal di mana hanya kajian mikroskopik dijalankan (makmal diagnostik klinikal rangkaian perubatan am).

Keputusan terbaik pemeriksaan mikroskopik diperoleh dengan menumpukan bahan diagnostik (contohnya, dengan sentrifugasi).

Untuk mengesan Mycobacterium tuberculosis dengan kebarangkalian 50% melalui mikroskop, 1 ml sputum mesti mengandungi lebih daripada 5,000 sel mikrob. Sputum daripada pesakit dengan bentuk paru-paru tuberkulosis biasanya mengandungi sejumlah besar bakteria tahan asid, yang membolehkan mereka dikesan dengan pasti oleh bacterioscopy. Sensitiviti diagnostik kaedah ini boleh ditingkatkan dengan memeriksa beberapa sampel kahak daripada seorang pesakit. Keputusan pemeriksaan bacterioscopic negatif tidak mengecualikan diagnosis tuberkulosis, kerana sputum sesetengah pesakit mengandungi lebih sedikit Mycobacterium daripada yang dapat dikesan oleh mikroskop. Penyediaan calitan kahak yang lemah juga boleh menjadi punca keputusan pemeriksaan bakterioskopi negatif.

Kaedah yang paling biasa untuk mengesan mikobakteria tahan asid dalam smear ialah pewarnaan Ziehl-Neelsen. Kaedah ini berdasarkan penembusan karbol fuchsin ke dalam sel mikrob melalui membran yang merangkumi lapisan lilin-lipid, dengan kesan pemanasan serentak dan tindakan etsa kuat fenol. Penyahwarnaan seterusnya bagi smear dengan larutan 25% asid sulfurik atau 3% alkohol hidroklorik membawa kepada penyahwarnaan semua struktur bukan tahan asid. Unsur-unsur smear yang tidak berwarna diwarnakan dengan larutan 0.3% metilena biru. Mycobacteria tidak melihat pewarna aniline konvensional, akibatnya mikobakteria tahan asid diwarnai merah raspberi, dan mikrob dan unsur selular lain berwarna biru.

Untuk memeriksa calitan yang diwarnakan mengikut Ziehl-Neelsen, gunakan mikroskop binokular ringan dengan objektif rendaman (pembesaran 90- atau 100 kali ganda) dan kanta mata dengan pembesaran 7- atau 10 kali ganda. 100 bidang pandangan diperiksa, yang mencukupi untuk mengesan mikobakteria tunggal dalam smear. Jika keputusan peperiksaan sedemikian adalah negatif, adalah disyorkan untuk memeriksa 200 lagi bidang pandangan untuk pengesahan. Keputusan direkodkan, menunjukkan bilangan mikobakteria tahan asid (AFB) yang dikesan.

Sebagai tambahan kepada kaedah ini, pewarnaan fluorochrome digunakan untuk mikroskop luminescent, yang membolehkan mencapai hasil terbaik. Penggunaan kaedah ini meningkatkan kecekapan mikroskop sebanyak 10-15%. Apabila mikobakteria dirawat dengan pewarna bercahaya (auramine, rhodamine, dsb.), bahan-bahan ini juga terikat pada struktur seperti lilin sel mikrob. Apabila sel bernoda disinari dengan sumber cahaya yang menarik (spektrum sinaran ultraungu tertentu), ia mula bersinar oren atau merah terang dengan latar belakang hitam atau hijau gelap. Oleh kerana kecerahan dan kontras yang tinggi bagi imej yang boleh dilihat, pembesaran keseluruhan mikroskop boleh dikurangkan sebanyak 4-10 kali ganda, yang memperluaskan medan pandangan dan mengurangkan masa tontonan penyediaan. Seiring dengan ini, disebabkan kedalaman medan yang jauh lebih besar, keselesaan kajian dapat ditingkatkan.

Apabila menggunakan mikroskop pendarfluor, melihat kawasan sapuan yang sama mengambil masa yang jauh lebih singkat daripada mikroskop cahaya sapuan yang diwarnakan menurut Ziehl-Neelsen. Jika seorang ahli mikroskop melihat kira-kira 20-25 smear sedemikian pada hari bekerja, maka dengan bantuan mikroskop pendarfluor dia boleh memeriksa lebih daripada 60-80 sampel dalam masa yang sama. Ahli mikroskop yang berpengalaman tahu bahawa pewarnaan sel dengan campuran auramine dan rhodamine dalam beberapa cara khusus untuk mikobakteria tahan asid, yang dalam kes ini mempunyai rupa batang emas. Saprofit berwarna kehijauan.

Satu lagi kelebihan penting kaedah mikroskop pendarfluor ialah keupayaan untuk mengesan mikobakteria yang diubah yang telah kehilangan sifat tahan asidnya di bawah pengaruh beberapa faktor yang tidak menguntungkan, khususnya kemoterapi intensif, dan oleh itu tidak dikesan oleh pewarnaan Ziehl-Neelsen.

Kelemahan kaedah mikroskop pendarfluor termasuk kos mikroskop yang agak tinggi dan operasinya. Walau bagaimanapun, dalam makmal berpusat atau makmal besar lain, di mana beban kerja melebihi norma tiga juruteknik makmal yang bekerja dengan tiga mikroskop konvensional, adalah lebih murah untuk menggunakan satu mikroskop pendarfluor.

Kaedah bakterioskopi mempunyai kekhususan yang agak tinggi (89-100%). Kira-kira 97% keputusan positif yang diperolehi oleh mana-mana kaedah mikroskopi jelas disahkan oleh hasil penyemaian.

Perlu diingatkan bahawa pemeriksaan mikroskopik terhadap sapuan bahan patologi tidak membenarkan seseorang untuk menentukan spesies mikobakteria tahan asid yang dikesan. Kaedah mikroskopik membolehkan seseorang membuat kesimpulan hanya tentang kehadiran atau ketiadaan mikroorganisma tahan asid dalam penyediaan, yang dijelaskan oleh kewujudan dalam sifat sejumlah besar mikroorganisma tahan asid bukan tuberkulosis secara morfologi serupa dengan mikobakteria kompleks tuberkulosis.

Penilaian keputusan mikroskopi dilakukan dalam unit separa kuantitatif.

Untuk dapat membandingkan keputusan kaedah mikroskopi yang berbeza, pekali empirikal diperkenalkan. Sebagai contoh, untuk membandingkan keputusan sapuan yang diwarnakan dengan pewarna pendarfluor dengan data kajian mikroskop cahaya (pembesaran 1000 kali ganda), adalah perlu untuk membahagikan bilangan mikobakteria tahan asid yang dikesan menggunakan mikroskop pendarfluor dengan pekali yang sepadan: pada pembesaran 250 kali ganda pada mikroskop - dengan 451 kali ganda. 630 kali ganda - dengan 2.

Ciri-ciri mikroskopi dalam tuberkulosis extrapulmonary

Mikroskopi langsung dilakukan, serta mikroskopi smear yang disediakan selepas pengayaan dengan pewarnaan seterusnya mengikut Ziehl-Neelsen atau pewarna pendarfluor. Mikroskopi langsung smear tidak berkesan kerana kepekatan mikobakteria yang rendah dalam bahan, dan oleh itu adalah lebih rasional untuk menggunakan kaedah pengayaan. Sentrifugasi adalah yang paling berkesan. Jika bahan biologi likat, sentrifugasi dengan homogenisasi serentak dan pencairan bahan digunakan, yang dijalankan menggunakan emparan berkelajuan tinggi dengan daya sentrifugasi 3000 g dan larutan hipoklorit. Kaedah pengayaan lain, seperti pengapungan mikro, tidak digunakan pada masa ini kerana pembentukan aerosol berbahaya secara biologi.

trusted-source[ 37 ]

Kaedah kultur untuk mendiagnosis tuberkulosis

Kaedah pembenihan, atau kaedah kultur, adalah lebih sensitif daripada mikroskop smear dan mempunyai beberapa kelebihan berbanding yang terakhir. Ia membolehkan mengesan beberapa dozen mikobakteria yang berdaya maju dalam bahan yang sedang diperiksa dan mempunyai nilai diagnostik yang tinggi. Ini amat penting apabila memeriksa bahan daripada pesakit yang baru didiagnosis atau dirawat yang mengeluarkan sejumlah kecil mikobakteria.

Berbanding dengan mikroskop, penyelidikan kultur membolehkan untuk meningkatkan bilangan pesakit tuberkulosis yang dikesan lebih daripada 15-25%, serta untuk mengesahkan tuberkulosis pada peringkat awal, apabila penyakit itu masih mudah dirawat. Kelebihan yang sangat penting dalam penyelidikan budaya dianggap sebagai kemungkinan mendapatkan budaya patogen, yang boleh dikenal pasti dan dikaji berhubung dengan kepekaan dadah, virulensi dan sifat biologi yang lain.

Kelemahan kaedah penanaman termasuk tempohnya (tempoh menunggu bahan mencapai 10 minggu), kos yang lebih tinggi, dan kerumitan pemprosesan bahan diagnostik.

Prinsip rawatan pra-menabur bahan diagnostik

Kaedah mikrobiologi konvensional tidak boleh digunakan untuk menjalankan ujian tuberkulosis. Ini disebabkan oleh fakta bahawa mikobakteria tuberkulosis tumbuh sangat perlahan, dan kebanyakan sampel klinikal mengandungi mikroorganisma dan kulat pyogenik dan reput yang berkembang pesat. Pertumbuhan pesat mereka pada media nutrien yang kaya mengganggu perkembangan mikobakteria dan tidak membenarkan patogen tuberkulosis diasingkan, jadi bahan diagnostik mesti dirawat sebelum disemai. Di samping itu, mikobakteria yang dikeluarkan dari saluran pernafasan pesakit biasanya dikelilingi oleh sejumlah besar lendir, yang menjadikannya sukar untuk menumpukan perhatiannya. Dalam hal ini, sebelum menyemai kahak dan bahan lain yang serupa, mereka mesti dicairkan dan dinyahcemar.

Semua detergen dan dekontaminasi mempunyai kesan toksik yang lebih atau kurang ketara pada mikobakteria. Hasil daripada rawatan, sehingga 90% daripada mikobakteria boleh mati. Untuk mengekalkan bahagian populasi mikobakteria yang mencukupi, adalah perlu untuk menggunakan kaedah rawatan lembut yang membolehkan, dalam satu tangan, untuk menyekat mikroorganisma pyogenik dan reput yang berkembang pesat, dan sebaliknya, untuk mengekalkan daya maju mikobakteria yang terdapat dalam bahan secara maksimum.

Bergantung pada bahan, kehomogenan dan tahap pencemarannya, pelbagai dekontaminasi digunakan untuk rawatan pra-pembenihan: untuk kahak - 4% larutan natrium hidroksida, 10% larutan trisodium fosfat, benzalkonium klorida trisodium fosfat, NALC-NaOH (N-acetyl-L-cysteine-natrium hidroksida) kepekatan air kencing 1% akhir yang lain. larutan asid sulfurik, untuk sampel tercemar, bahan yang mengandungi lemak - larutan asid oksalik sehingga 5%. Di samping itu, dalam beberapa kes, enzim dan surfaktan (detergen) digunakan. Penggunaan Tween dan beberapa detergen lain disertai dengan kematian sel mikobakteria yang lebih rendah (40-50% bertahan). Walau bagaimanapun, ia hanya boleh digunakan untuk bahan cecair. NALC-NaOH, dihasilkan dalam kit, adalah yang paling banyak digunakan di dunia. Kaedah ini membolehkan untuk mengasingkan lebih daripada 85% populasi sel mikobakteria. Dekontaminasi bahan pepejal yang mengandungi tisu adalah lebih sukar, kerana sukar untuk meneka tahap penyebaran bahan semasa homogenisasi. Sebagai contoh, pemprosesan biopsi nodus limfa sering disertai dengan peningkatan kekerapan pencemaran dengan flora asing. Dalam kes ini, 1% etonium boleh digunakan.

Bahan tidak homogen dihomogenkan menggunakan manik kaca dengan kehadiran bahan penyahcemar. Bahan cecair pra-emparan dan hanya sedimen diproses.

Teknik menyemai dan mengeram

Selepas pemprosesan awal, bahan itu disentrifugasi, yang memendakan mikobakteria dan meningkatkan kandungannya dalam sedimen ("pengayaan sedimen"). Enapan yang terhasil dinetralkan dan disuntik ke atas permukaan media nutrien padat atau tabung uji dengan media cecair (separuh cecair). Calitan untuk pemeriksaan mikroskopik disediakan daripada sedimen yang tinggal. Teknik pembenihan mesti mengelakkan pencemaran silang bahan diagnostik.

Untuk tafsiran klinikal yang boleh dipercayai tentang hasil penyelidikan mikrobiologi, peraturan berikut mesti dipatuhi: kajian mikroskopik dan budaya mesti dilakukan secara selari daripada sampel bahan diagnostik yang sama.

Tiub yang disuntik diletakkan dalam termostat pada 37 o C selama 2 hari dalam kedudukan mendatar. Ini memastikan penyerapan bahan yang lebih seragam ke dalam medium nutrien. Selepas 2 hari, tiub dialihkan ke kedudukan menegak dan ditutup rapat dengan penyumbat getah atau silikon untuk mengelakkan media benih daripada kering.

Tanaman disimpan dalam termostat pada suhu 37 ° C selama 10-12 minggu dengan pemeriksaan mingguan biasa. Parameter berikut direkodkan pada setiap pemeriksaan kawalan:

  • tempoh pertumbuhan yang boleh dilihat secara visual dari hari menyemai;
  • kadar pertumbuhan (bilangan CFU);
  • pencemaran budaya dengan flora atau kulat mikrob asing (tiub ujian tersebut dikeluarkan);
  • tiada pertumbuhan yang kelihatan. Tiub dibiarkan dalam termostat sehingga pemeriksaan seterusnya.

Media nutrien

Pelbagai media nutrien digunakan untuk memupuk mikobakteria: pepejal, separa cecair, cecair. Walau bagaimanapun, tiada satu pun daripada media nutrien yang diketahui mempunyai sifat yang memastikan pertumbuhan semua sel mikobakteria. Dalam hal ini, untuk meningkatkan kecekapan, disyorkan untuk menggunakan 2-3 media nutrien komposisi yang berbeza secara serentak.

Sebagai medium standard untuk pengasingan utama patogen tuberkulosis dan penentuan sensitiviti ubatnya, WHO mengesyorkan medium Lowenstein-Jensen. Ini adalah medium telur padat di mana pertumbuhan mikobakteria diperoleh pada hari ke-20-25 selepas menyemai bahan positif bakteria. Menyemai bahan negatif bakteria memerlukan tempoh inkubasi yang lebih lama (sehingga 10-12 minggu).

Di negara kita, medium telur Finn-II yang dicadangkan oleh ER Finn telah meluas. Ia berbeza kerana bukannya L-asparagine, ia menggunakan natrium glutamat, yang mencetuskan laluan lain untuk sintesis asid amino dalam mikobakteria. Pertumbuhan muncul pada medium ini agak awal, dan kekerapan pengasingan mikobakteria adalah 6-8% lebih tinggi daripada pada medium Lowenstein-Jensen.

Untuk meningkatkan kecekapan diagnostik bakteriologi tuberkulosis ekstrapulmonari, adalah dinasihatkan untuk memasukkan media Finn-II yang diubah suai dalam kompleks media nutrien. Untuk mempercepatkan pertumbuhan, 0.05% natrium thioglycolate juga dimasukkan ke dalam medium nutrien Finn-II, yang mengurangkan kepekatan oksigen. Untuk melindungi sistem enzim mikobakteria daripada produk toksik peroksidasi lipid, antioksidan α-tokoferol asetat dimasukkan ke dalam medium nutrien Finn-II pada kepekatan 0.001 μg/ml. Bahan diagnostik disemai menggunakan kaedah standard.

Di makmal anti-tuberkulosis di Rusia, pengubahsuaian lain media nutrien padat juga digunakan: medium nutrien "Novaya" yang dicadangkan oleh GG Mordovsky, media nutrien A-6 dan A-9 yang dibangunkan oleh VA Anikin, dsb.

Disebabkan fakta bahawa semasa kemoterapi, kerosakan berlaku kepada pelbagai sistem metabolik sel mikrob, sebahagian daripada populasi mikobakteria kehilangan keupayaan untuk berkembang secara normal pada media nutrien konvensional dan memerlukan media nutrien yang seimbang osmotik (separa cecair atau cecair).

Penilaian dan merekodkan hasil budaya bahan diagnostik

Sesetengah strain dan jenis mikobakteria tumbuh dengan perlahan, pertumbuhan mungkin muncul walaupun pada hari ke-90. Bilangan kultur sedemikian adalah kecil, tetapi ini memaksa penyemaian disimpan dalam termostat selama 2.5-3 bulan.

Kultur virulen Mycobacterium tuberculosis biasanya tumbuh pada media telur pepejal sebagai koloni bentuk-R dengan saiz dan rupa yang berbeza-beza. Koloni kering, berkedut, berwarna gading, dan sedikit berpigmen. Pada media lain, koloni Mycobacterium tuberculosis mungkin lebih lembap. Selepas kursus kemoterapi atau semasa rawatan, koloni licin dengan pertumbuhan lembap (bentuk-S) boleh diasingkan.

Apabila mengasingkan kultur, satu set kajian khas digunakan untuk membezakan mikobakteria tuberkulosis daripada mikobakteria bukan tuberkulosis dan saprofit tahan asid.

Jawapan positif diberikan selepas pemeriksaan mikroskopik mandatori bagi sapuan dari koloni tumbuh yang diwarnakan mengikut Ziehl-Neelsen. Dalam kes pertumbuhan mikobakteria, batang merah terang ditemui dalam smear, berbaring secara tunggal atau berkumpulan, membentuk kelompok dalam bentuk felt atau jalinan. Dalam budaya muda, terutamanya yang diasingkan daripada pesakit yang dirawat dengan kemoterapi untuk masa yang lama, mikobakteria dibezakan oleh polimorfisme yang jelas, sehingga kehadiran varian pendek, hampir coccoid atau memanjang yang menyerupai miselium kulat, bersama-sama dengan bentuk berbentuk batang.

Keamatan pertumbuhan mikobakteria ditetapkan mengikut skema berikut: (+) - 1-20 CFU dalam tabung uji (perkumuhan bakteria rendah); (++) - 20-100 CFU dalam tabung uji (perkumuhan bakteria sederhana); (+++) - >100 CFU dalam tabung uji (perkumuhan bakteria yang banyak). Dalam diagnostik makmal tuberkulosis, tidak cukup untuk memberikan jawapan yang menunjukkan sama ada mikobakteria telah dikesan atau tidak dengan kaedah tertentu. Ia juga perlu untuk mempunyai idea terperinci tentang jumlah dan sifat populasi mikobakteria, komposisi dan sifatnya. Data inilah yang membolehkan seseorang mentafsir dengan betul keadaan proses, merancang taktik dan segera menyesuaikan rawatan.

Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, media nutrien berasaskan agar dengan pelbagai bahan tambahan pertumbuhan dan penggunaan campuran gas khas telah dicadangkan untuk mempercepatkan pertumbuhan mikobakteria. Untuk mendapatkan pertumbuhan mikobakteria pada media ini, suasana dengan peningkatan kandungan karbon dioksida (4-7%) dicipta semasa penanaman. Untuk tujuan ini, inkubator CO2 khas digunakan . Walau bagaimanapun, sistem penanaman mikobakteria automatik telah menerima perkembangan terbesar: MGIT-BACTEC-960 dan MB/Bact.

Salah satu sistem sedemikian ialah sistem MGIT (tubuh menunjukkan pertumbuhan mikobakteria), yang merupakan pembangunan berteknologi tinggi dan direka untuk diagnostik bakteriologi dipercepatkan tuberkulosis dan penentuan kepekaan mikobakteria kepada ubat lini pertama dan beberapa ubat baris kedua. MGIT direka untuk digunakan sebagai sebahagian daripada peranti VASTEC-960. Mikroorganisma ditanam dalam tabung uji khas dengan medium nutrien cecair berdasarkan medium Middlebrook-7H9 yang diubah suai. Untuk merangsang pertumbuhan mikobakteria dan menyekat pertumbuhan mikroflora asing, MGIT Growth Supplement dan campuran ubat antibakteria PANTA digunakan.

Pertumbuhan mikroorganisma didaftarkan secara optik. Ia berdasarkan pendarfluor, yang berlaku apabila mikobakteria mengambil oksigen semasa pertumbuhannya. Pewarna fluorokrom yang bergantung kepada oksigen terkandung di bahagian bawah tabung uji khas dan ditutup dengan lapisan silikon. Pembiakan mikobakteria membawa kepada penurunan jumlah oksigen dalam tabung uji dan penurunan kepekatannya, yang menyebabkan peningkatan dalam pendarfluor, yang menjadi kelihatan apabila tabung uji disinari dengan cahaya ultraungu dan secara automatik didaftarkan oleh fotosensor yang dibina ke dalam peranti VASTES-960. Keamatan luminescence didaftarkan dalam unit pertumbuhan (GU). Data pertumbuhan dimasukkan secara automatik ke dalam komputer, di mana ia boleh disimpan. Analisis komputer keluk pertumbuhan boleh memberikan maklumat tentang kehadiran pelbagai kumpulan mikobakteria, termasuk yang bukan tuberkulosis, dan juga membantu menilai sifat pertumbuhan mikobakteria.

Hasil daripada pengenalan sistem sedemikian, masa pertumbuhan mikobakteria telah dikurangkan dengan ketara, dengan purata 11 hari pada VASTEC-960 dan 19 hari pada MB/Bact berbanding 33 hari pada medium nutrien padat standard. Perlu diingatkan bahawa sistem ini memerlukan kakitangan yang berkelayakan tinggi. Menyemai bahan pada media cecair semestinya disertai dengan menyemai pada medium Lowenstein-Jensen, yang memainkan peranan sebagai sandaran dalam kes di mana mikobakteria tuberkulosis tidak tumbuh pada media lain.

trusted-source[ 38 ], [ 39 ], [ 40 ], [ 41 ], [ 42 ], [ 43 ]

Penentuan kerentanan dadah terhadap mikobakteria

Penentuan spektrum dan tahap sensitiviti mikobakteria kepada ubat anti-tuberkulosis adalah kepentingan klinikal yang besar, serta untuk penilaian epidemiologi penyebaran tuberkulosis yang tahan dadah. Di samping itu, pemantauan rintangan dadah membolehkan kami menilai keberkesanan program anti-tuberkulosis secara keseluruhan, menjadi penunjuk penting bagi kerja semua komponen langkah anti-tuberkulosis.

Kekerapan dan masa ujian kerentanan dadah:

  • sebelum permulaan rawatan, sekali untuk menentukan strategi dan taktik rawatan:
  • Apabila mengasingkan kultur daripada pelbagai bahan daripada pesakit (kahak, BAL, air kencing, eksudat, cecair serebrospinal, dll.), semua strain terpencil diperiksa:
  • pada akhir fasa intensif rawatan tanpa ketiadaan dinamik klinikal dan radiologi:
  • jika perlu untuk menukar rejimen rawatan sekiranya:
    • ketiadaan negatif sputum;
    • kultur semula selepas negatif sputum;
    • peningkatan mendadak dalam jumlah AFB dalam smear selepas penurunan awal. Telah diketahui umum bahawa strain Mycobacterium tuberculosis dengan sensitiviti ubat yang berbeza diasingkan daripada bahan daripada pesakit dengan tuberkulosis. Kepekaan strain terhadap ubat anti-tuberkulosis mungkin berbeza dalam spektrum ubat, darjah, kekerapan dan kelajuan perkembangan rintangan.

Tahap rintangan dadah Mycobacterium tuberculosis ditentukan mengikut kriteria yang ditetapkan, yang memberi tumpuan kepada kepentingan klinikal rintangan dan bergantung kepada aktiviti anti-tuberkulosis ubat, farmakokinetiknya, kepekatan dalam lesi, dos terapeutik maksimum, dsb.

Penentuan kerentanan dadah mikobakteria kini dijalankan menggunakan kaedah mikrobiologi:

  • kepekatan mutlak (kaedah pencairan pada media nutrien pepejal atau cecair),
  • perkadaran,
  • pekali rintangan.

Biasanya, rintangan ditunjukkan dalam bentuk pertumbuhan koloni mycobacteria tuberculosis yang diperhatikan secara visual, bagaimanapun, terdapat kaedah yang mendorong pertumbuhan pada peringkat awal pembahagian sel mikobakteria dalam bentuk tindak balas warna. Kaedah ini mengurangkan masa ujian dari 3-4 kepada 2 minggu.

Kaedah kepekatan mutlak yang disyorkan oleh Jawatankuasa Kemoterapi WHO telah meluas di Rusia sebagai kaedah bersatu. Dari sudut metodologi, ia adalah yang paling mudah, tetapi memerlukan standardisasi yang tinggi dan ketepatan prosedur makmal. Ujian kerentanan dadah terdiri daripada satu set tabung uji dengan medium nutrien yang diubah suai dengan ubat anti-tuberkulosis. Set ini terdiri daripada 2-3 tabung uji dengan kepekatan berbeza bagi setiap ubat yang digunakan, satu tabung uji kawalan dengan medium tanpa ubat, dan satu tabung uji yang mengandungi 1000 μg/ml natrium salisilat atau 500 μg/ml asid paranitrobenzoik untuk mengesan pertumbuhan mikobakteria bukan tuberkulosis.

Untuk menyediakan satu set media dengan persediaan, gunakan medium Lowenstein-Jensen yang diubah suai (tanpa kanji), yang dituangkan ke dalam kelalang. Isipadu tertentu pencairan sepadan ubat anti-tuberkulosis ditambah kepada setiap kelalang. Kandungan kelalang dicampur dengan teliti, dituangkan ke dalam tabung uji dan digumpalkan dalam kedudukan condong selama 40 minit pada suhu 85 ° C. Adalah disyorkan untuk menggumpalkan medium dalam koagulator elektrik dengan kawalan suhu automatik. Sederhana dengan ubat anti-tuberkulosis

Baris pertama boleh disimpan di dalam peti sejuk pada suhu 2-4 °C selama 1 bulan, dengan ubat baris kedua - tidak lebih daripada 2 minggu. Penyimpanan media dengan ubat pada suhu bilik tidak boleh diterima. Apabila menyediakan penyelesaian ubat anti-tuberkulosis, aktiviti mereka diambil kira, mengira kepekatan dengan pelarasan untuk berat molekul bahagian bukan spesifik ubat, ketulenan, dll. Untuk menentukan kepekaan dadah, hanya bahan tulen kimia yang digunakan.

Prinsip kaedah ini adalah untuk menentukan kepekatan ubat anti-tuberkulosis yang menyekat pertumbuhan sebahagian besar populasi mikobakteria. Apabila dilakukan dengan betul, kaedah ini mempunyai kebolehpercayaan yang baik.

Sebelum menjalankan ujian, adalah perlu untuk memastikan bahawa budaya terpencil Mycobacterium tuberculosis tidak mengandungi mikroflora luar. Suspensi homogen yang mengandungi 500 juta badan mikrob dalam 1 ml (standard kekeruhan optik 5 unit) disediakan daripada kultur mikobakteria dalam larutan natrium klorida 0.9%. Suspensi yang terhasil dicairkan dengan larutan natrium klorida 0.9% (1:10) dan 0.2 ml ampaian ditambahkan ke setiap tabung uji set media nutrien. Tabung uji yang disuntik diletakkan dalam termostat pada suhu 37 °C dan disimpan secara mendatar selama 2-3 hari supaya permukaan senget medium nutrien disemai secara seragam dengan penggantungan Mycobacterium tuberculosis. Kemudian tabung uji dialihkan ke kedudukan menegak dan diinkubasi selama 3-4 minggu. Keputusan direkodkan selepas 3-4 minggu.

Memandangkan masa yang diperlukan untuk mengasingkan patogen daripada bahan klinikal pada media nutrien adalah sekurang-kurangnya 1-1.5 bulan, hasil penentuan kerentanan dadah menggunakan kaedah ini boleh diperoleh tidak lebih awal daripada 2-2.5 bulan selepas pembenihan bahan. Ini adalah salah satu kelemahan utama kaedah.

Keputusan ujian kerentanan dadah mikobakteria ditafsirkan berdasarkan kriteria tertentu. Pada media pepejal, kultur dianggap sensitif terhadap kepekatan ubat yang terkandung dalam medium jika bilangan koloni mikobakteria yang tumbuh pada tabung uji tertentu dengan ubat tidak melebihi 20 dengan pertumbuhan yang banyak pada tabung uji kawalan tanpa ubat. Hanya jika terdapat lebih daripada 20 koloni, budaya dianggap tahan terhadap kepekatan tertentu. Dalam praktiknya, apabila hasil pertumbuhan dalam tabung uji hampir 20 CFU diperoleh, adalah perlu untuk memberitahu unit klinikal bahawa sensitiviti atau rintangan dalam kes ini adalah sempadan, kerana ini kadangkala boleh menjelaskan dinamik penunjuk klinikal yang tidak jelas.

Untuk pelbagai persediaan, kepekatan tertentu ditubuhkan di mana pembiakan bahagian kritikal populasi mikobakteria diperhatikan. Kepekatan ini dipanggil "kritikal". Magnitud pertumbuhan populasi mikobakteria pada medium nutrien dengan penyediaan dalam kepekatan kritikal digunakan sebagai kriteria untuk kestabilan.

Dalam amalan ftisiologi domestik, apabila menentukan rintangan dadah, mereka tidak terhad kepada menentukan hanya kepekatan kritikal. Ini disebabkan oleh fakta bahawa definisi yang diperluaskan tentang tahap rintangan dadah patogen membolehkan doktor untuk merumuskan taktik kemoterapi dengan lebih betul, menggunakan pengetahuan tentang kesan potensi gabungan ubat, untuk menjangka rintangan silang atau menggunakan ubat yang lebih berkesan daripada kumpulan ubat anti-tuberkulosis yang digunakan.

Kaedah kepekatan mutlak adalah yang paling mudah, tetapi juga paling sensitif terhadap kesilapan yang dibuat dalam pelaksanaannya. Lebih dipercayai, terutamanya apabila menentukan sensitiviti kepada ubat baris kedua, dan meluas di luar Rusia adalah kaedah perkadaran. Ia mengambil kira kelemahan kaedah penumpuan mutlak, tetapi ia lebih intensif buruh untuk dilaksanakan.

Kaedah ini hampir sama dengan kaedah kepekatan mutlak. Penyediaan tabung uji dengan ubat adalah sama seperti dalam kaedah kepekatan mutlak. Walau bagaimanapun, dos benih penggantungan mycobacterium tuberkulosis dikurangkan sebanyak 10 kali, yang menghapuskan kekerapan rintangan spontan beberapa strain mycobacterium tuberkulosis kepada ubat-ubatan seperti Ethambutol, prothionamide, capreomycin. Sebagai kawalan, 2 atau 3 tiub dengan dos benih yang sama dengan yang di dalam tabung uji, dicairkan 10 dan 100 kali berturut-turut, digunakan. Kriteria untuk rintangan adalah bahagian pertumbuhan mycobacterium tuberkulosis yang diperhatikan secara visual. Untuk ubat baris pertama, kriteria untuk rintangan adalah pertumbuhan berlebihan sebanyak 1% daripada populasi awal, untuk ubat baris ke-2 - pertumbuhan 1 atau lebih daripada 10% daripada awal, bergantung pada kepekatan kritikal yang dipilih.

Pada tahun 1997, WHO dan kumpulan kerja International Union Against Tuberculosis dalam pengesanan rintangan ubat anti-tuberkulosis membuat pelarasan kepada kriteria ini, mencadangkan untuk mempertimbangkan mikobakteria yang tumbuh pada medium telur Lowenstein-Jensen yang padat pada kepekatan berikut sebagai tahan:

  • dihydrostreptomycin - 4 μg/ml;
  • isoniazid - 0.2 µg/ml:
  • rifampisin - 40 mcg/ml:
  • Etambutol - 2 mcg/ml.

Pada tahun 2001, kepekatan kritikal telah dicadangkan untuk ubat baris kedua berikut (untuk bahagian kritikal 1%):

  • capreomycin - 40 mcg/ml;
  • protionamide - 40 mcg/ml;
  • kanamycin - 30 μg/ml;
  • viomycin - 30 μg/ml;
  • sikloserin - 40 mcg/ml;
  • asid aminosalicylic - 0.5 mcg/ml;
  • ofloxacin - 2 mcg/ml.

Keputusan pertumbuhan dinilai selepas 4 minggu sebagai permulaan dan selepas 6 minggu penanaman sebagai muktamad.

Untuk menentukan kerentanan dadah kepada pyrazinamide, yang digunakan secara meluas dalam kemoterapi tuberkulosis moden, kepekatan kritikal yang disyorkan ialah 200 μg/ml. Walau bagaimanapun, masih tiada kaedah yang diterima umum untuk menentukan rintangan ubat terhadap ubat ini pada media nutrien pepejal, kerana aktiviti antibakterianya hanya ditunjukkan dalam persekitaran berasid (pH <6), yang secara teknikalnya sukar untuk dikekalkan. Di samping itu, banyak kultur klinikal Mycobacterium tuberculosis enggan tumbuh pada media telur dengan persekitaran berasid.

Untuk menilai kualiti keputusan menentukan kerentanan dadah mikobakteria, disyorkan untuk mengawal setiap kumpulan baru medium Lowenstein-Jensen dengan penentuan selari kerentanan strain muzium standard H37Rv. Di samping itu, terdapat kriteria mikrobiologi tertentu yang mesti dipenuhi supaya kaedah memberikan hasil yang boleh dihasilkan dengan baik dan ditafsirkan dengan betul. Ini termasuk daya maju budaya mikobakteria tuberkulosis, peraturan untuk mendapatkan penggantungan dan penggantungan homogen, peraturan untuk memilih kultur mikobakteria tuberkulosis, dan keterwakilan jisim bakteria yang dipilih. Kebolehpercayaan untuk menentukan rintangan dadah berkurangan dengan perkumuhan bakteria yang sangat lemah.

Baru-baru ini, kaedah menentukan kerentanan dadah menggunakan sistem automatik telah diiktiraf sebagai menjanjikan. Yang paling maju dalam bidang ini ialah pembangunan berdasarkan VASTEC MGIT-960. Dalam kes ini, kerentanan dadah mikobakteria tuberkulosis ditentukan berdasarkan kaedah perkadaran yang diubah suai. Semasa penentuan, kadar pertumbuhan mikobakteria tuberkulosis dalam tiub kawalan dan dalam tiub dengan ubat dibandingkan. Untuk menentukan kerentanan terhadap streptomycin, isoniazid, rifampicin dan etambutol, aditif pengayaan dan antibiotik yang termasuk dalam kit SIRE digunakan. Untuk menentukan kerentanan kepada pyrazinamide, kit PZA digunakan. Semasa ujian, tiub uji dengan ubat-ubatan disuntik dengan penggantungan mikobakteria tuberkulosis, serta tiub kawalan dengan pencairan 100 kali ganda penggantungan untuk semua ubat, dengan pengecualian pyrazinamide, di mana pencairan penggantungan adalah 10 kali. Kriteria untuk kestabilan ialah penunjuk pertumbuhan mikobakteria 100 GU apabila pertumbuhan dalam tiub kawalan mencapai 400 GU (lihat "Kaedah budaya untuk mengasingkan mikobakteria"). Keputusan direkodkan dan ditafsirkan secara automatik dan ditetapkan oleh program yang dimasukkan atau dipilih.

Kepekatan akhir dalam tabung uji dengan medium nutrien cecair digunakan sebagai kepekatan kritikal. Pada masa ini, kepekatan kritikal telah dibangunkan untuk kedua-dua ubat baris pertama dan beberapa ubat baris kedua. Perlu diingatkan bahawa penentuan sensitiviti mikobakteria tuberkulosis kepada sikloserin dan asid aminosalicylic hanya dilakukan pada media nutrien telur.

Protokol terperinci untuk bekerja dengan sistem yang diterangkan membolehkan ujian kerentanan dadah pada kedua-dua budaya terpencil (dengan medium nutrien padat) dan menggunakan pertumbuhan utama mikobakteria dalam tiub ujian MGIT. Pilihan terakhir mengurangkan dengan ketara masa yang diperlukan untuk menjalankan kajian budaya, membolehkan keputusan penuh mengenai kultur mikobakteria tuberkulosis (termasuk maklumat tentang kerentanan dadah) diperolehi dalam tempoh 3 minggu selepas mengumpul bahan, manakala kaedah tradisional hanya boleh menyediakannya pada bulan ke-3. Keputusan yang tepat pada masanya, apabila pesakit berada dalam fasa rawatan intensif, boleh mengimbangi kos kajian yang relatif tinggi.

trusted-source[ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ], [ 48 ], [ 49 ], [ 50 ]

Pembezaan mikobakteria

Memandangkan media nutrien yang digunakan tidak selektif ketat, pembezaan seterusnya bagi mikobakteria terpencil dianggap wajib. Keperluan untuk pembezaan mikobakteria adalah disebabkan oleh beberapa ciri proses patologi yang disebabkan oleh wakil-wakil genus: kursus yang berbeza dan hasil tuberkulosis dan mikobakteriosis, kehadiran rintangan ubat semulajadi terhadap beberapa ubat anti-tuberkulosis.

Adalah diakui bahawa pengenalpastian utama mikobakteria kompleks M. tuberkulosis daripada mikobakteria bukan tuberkulosis dijalankan mengikut ciri-ciri berikut: kadar pertumbuhan pada media nutrien padat, pembentukan pigmen, morfologi koloni, kehadiran rintangan asid dan suhu optimum untuk pertumbuhan.

Malangnya, tiada kaedah makmal tunggal yang boleh membezakan mycobacteria kompleks M. tuberculosis daripada mikobakteria tahan asid yang lain; bagaimanapun, gabungan tanda-tanda yang diterangkan di atas dengan keputusan beberapa ujian biokimia yang diberikan di bawah membolehkan pengecaman mikobakteria kompleks M. tuberkulosis dengan kebarangkalian sehingga 95%.

Untuk membezakan mikobakteria kompleks M. tuberkulosis (M. tuberkulosis, M. bovis, M. bovisBCG, M. africanum, M. microti, M. canettii dan lain-lain) daripada mikobakteria bukan tuberkulosis yang tumbuh secara perlahan, ujian biokimia asas digunakan untuk mengesan kehadiran tanda-tanda berikut:

  • keupayaan untuk menghasilkan asid nikotinik (ujian niasin):
  • aktiviti reduktase nitrat;
  • katalase termostabil;
  • pertumbuhan pada medium dengan natrium salisilat (1 mg/ml).

Sebagai ujian tambahan, ujian pertumbuhan pada medium yang mengandungi 500 μg/ml asid para-nitrobenzoik atau 5% natrium klorida juga boleh digunakan.

Banyak makmal bakteriologi mengenal pasti mikroorganisma ini hanya pada tahap yang kompleks, yang disebabkan oleh keupayaan makmal yang terhad dan keupayaan metodologi pakar.

Dalam kebanyakan kes dalam amalan, ujian berikut adalah mencukupi untuk membezakan M. tuberculosis dan M. bovis: niasin, nitrat reduktase, pyrazinamidase, dan pendaftaran pertumbuhan pada medium yang mengandungi 2 μg/ml thiophene-2-carboxylic acid hydrazide. Ia diambil kira bahawa mikobakteria kompleks M. tuberkulosis dicirikan oleh set ciri berikut:

  • pertumbuhan perlahan (lebih daripada 3 minggu);
  • suhu pertumbuhan dalam lingkungan 35-37 o C;
  • ketiadaan pigmentasi (warna gading);
  • pewarnaan cepat asid;
  • ujian niasin positif;
  • ujian reduktase nitrat positif;
  • ketiadaan katalase termostable (68 o C).
  • kekurangan pertumbuhan pada medium Lowenstein-Jensen yang mengandungi:
    • 1000 µg/ml asid salisilik natrium,
    • 500 mcg/ml asid para-nitrobenzoik,
    • 5% natrium klorida:
  • pertumbuhan dengan kehadiran 1-5 μg/ml asid tiofen-2-karboksilik.

Perkaitan pembezaan mikobakteria terpencil akan meningkat dengan ketara dengan pertumbuhan kekerapan pendaftaran kes HIV/AIDS yang berkaitan dengan tuberkulosis atau mikobakteriosis. Pada masa ini, tidak ada kepastian mutlak tentang kesediaan makmal serantau praktikal untuk melaksanakan jumlah kerja ini dengan betul.

trusted-source[ 51 ], [ 52 ], [ 53 ], [ 54 ], [ 55 ], [ 56 ], [ 57 ], [ 58 ]

Diagnosis imunologi tuberkulosis

Terdapat beberapa fenomena universal, persediaan dan ujian imunologi yang pada mulanya ditemui secara khusus dalam tuberkulosis atau dalam model tindak balas imun terhadap mikobakteria. Ini termasuk BCG dan tuberculin, seperti fenomena seperti DST kulit (ujian tuberculin - tindak balas Pirquet dan Mantoux), tindak balas kepada pentadbiran subkutaneus tuberculin kepada haiwan yang sensitif (fenomena Koch). Beberapa antibodi pertama dalam penyakit berjangkit juga ditemui dalam tuberkulosis. Sudah tentu, semakin mendalam pemahaman tentang mekanisme imuniti anti-tuberkulosis dan kawalan genetiknya, semakin luas penggunaan kaedah dan persediaan imunologi yang mempengaruhi imuniti untuk menyelesaikan masalah praktikal phthisiology.

Masalah praktikal yang paling penting dan kompleks pada masa ini dianggap sebagai pengesanan tuberkulosis dalam proses saringan besar-besaran penduduk. Walau bagaimanapun, walaupun terdapat banyak laporan "kejayaan" (pada bahan terhad), tiada kaedah imunologi (boleh dihasilkan semula dalam "mana-mana tangan") atau ubat yang sesuai untuk tujuan ini.

Kaedah imunologi, khususnya kajian serologi (penentuan antigen, antibodi) dan ujian provokasi tuberkulin, digunakan secara meluas dalam amalan klinikal.

Kaedah serologi, yang menentukan antigen dan antibodi dalam persekitaran badan yang berbeza, berada di tempat pertama di kalangan kajian imunologi yang digunakan dalam diagnostik pembezaan.

Kekhususan penentuan antibodi kepada mycobacteria tuberculosis bergantung pada antigen yang digunakan dalam analisis imun. Sebilangan besar antigen telah dicadangkan, yang pertama ialah tuberculin PPD:

  • PPD dan persediaan kompleks lain daripada cecair kultur;
  • penghancur ultrasonik;
  • Ekstrak Triton dan persediaan dinding sel kompleks lain;
  • 5-antigen (Daniel);
  • 60-antigen (Coccito);
  • lipoarabinomanan;
  • faktor kord (trehalose-6,6-di-mycolate);
  • fenolik dan glikolipid lain;
  • lipopolisakarida;
  • antigen pengikat fibronektin;
  • protein (paling kerap rekombinan); 81,65,38,34,30,19,18,16,15.12 KDA, dsb.

Hasil daripada penyelidikan bertahun-tahun oleh saintis Rusia dan asing, corak utama pembentukan antibodi dan keberkesanan diagnostik serologi tuberkulosis telah dikenalpasti: semakin kompleks antigen, semakin tinggi sensitiviti dan semakin rendah kekhususan ujian. Kekhususan berbeza-beza di negara yang berbeza bergantung kepada jangkitan populasi dengan M. tuberkulosis dan mikobakteria bukan tuberkulosis, pada vaksinasi BCG, dll. Pada kanak-kanak, maklumat serodiagnostik adalah lebih rendah daripada orang dewasa. Dalam tuberkulosis primer (lebih kerap kanak-kanak), penentuan IgM adalah lebih bermaklumat; dalam tuberkulosis sekunder - IgG. Pada orang yang dijangkiti HIV, kemakluman serodiagnostik dalam menentukan antibodi dikurangkan. Keberkesanan penentuan antibodi bergantung kepada beberapa "detik klinikal": aktiviti proses (kehadiran atau ketiadaan "pengasingan" mikobakteria, kehadiran rongga pereputan, tahap penyusupan), kelaziman proses, tempoh perjalanannya.

Kepekaan kaedah enzim immunoassay (EIA) adalah kira-kira 70%. Keberkesanan kajian yang tidak mencukupi adalah disebabkan kekhususannya yang rendah. Sebelum ini, kemungkinan menggunakan pemeriksaan serologi dalam kumpulan berisiko tinggi telah dipertimbangkan, khususnya di kalangan orang yang mengalami perubahan post-tuberkulosis dalam paru-paru.

Untuk meningkatkan kekhususan ELISA, antigen yang lebih spesifik sedang dicari, termasuk yang diperoleh melalui kejuruteraan genetik: ESAT-6, dsb. (lihat di atas). Penggunaan antigen khusus yang ketat (38 kDa, ESAT) meningkatkan kekhususan, tetapi dengan ketara mengurangkan sensitiviti analisis. Bersama-sama dengan ELISA (sistem ujian makmal eksperimen, seperti kit Pathozyme ELISA), kit immunochromatographic dengan penapisan sisi (Mycodot) turut ditawarkan, serta ujian lain yang serupa (analisis titik membran) dengan penilaian visual hasil ujian. Semasa menjalankan ujian ini, analisis mengambil masa 10-30 minit; mereka tidak memerlukan peralatan khas, mereka memerlukan penilaian visual keputusan, yang dikaitkan dengan subjektiviti tertentu. Kaedah ini mempunyai kira-kira ciri kepekaan dan kekhususan yang sama (masing-masing 70% dan 90-93%) seperti ELISA tradisional.

Penggunaan kaedah analisis imun mempunyai nilai tertentu sebagai kaedah tambahan yang diambil kira dalam kompleks kaedah yang digunakan dalam diagnosis pembezaan tuberkulosis, terutamanya dalam diagnosis bentuk ekstrapulmonarinya. Kaedah ELISA paling berkesan dalam diagnosis meningitis tuberkulosis apabila memeriksa cecair serebrospinal. Dalam kes ini, sensitiviti analisis adalah 80-85%, dan kekhususan ialah 97-98%. Terdapat maklumat tentang keberkesanan menentukan antibodi kepada Mycobacterium tuberculosis dalam cecair pemedih mata dalam diagnosis uveitis tuberkulosis.

Induksi sintesis interferon gamma secara in vitro

Gamma interferon (IFN-γ) adalah faktor perlindungan imun khusus, direalisasikan dengan mengaktifkan sistem enzim makrofaj. Induksi sintesis IFN-γ oleh T-limfosit tersensitisasi disebabkan oleh interaksinya dengan antigen mikobakteria.

Kedua-dua PPD tuberculin dan antigen khusus yang diperoleh melalui kejuruteraan genetik digunakan sebagai antigen, khususnya antigen ESAT-6 (antigen yang dirembeskan awal dengan berat molekul 6 kDa) dan CFP-10 (protein filtrat kultur, 10 kDa). Antigen kejuruteraan genetik atau rekombinan tidak terdapat dalam sel-sel vaksin BCG dan mikobakteria lain. Apabila menggunakan tuberculin, keputusan ujian induksi IFN-γ adalah setanding dengan keputusan ujian kulit tuberculin (korelasi langsung). Apabila menggunakan antigen kejuruteraan genetik, keputusan ujian adalah lebih spesifik dan tidak bergantung pada vaksinasi BCG sebelumnya. Apabila memeriksa individu yang diberi vaksin yang tidak pernah bersentuhan dengan jangkitan tuberkulosis, kekhususan ujian adalah 99%. Kepekaan ujian di kalangan pesakit tuberkulosis adalah antara 81 hingga 89%.

Ujian dan diagnostik telah dibangunkan berdasarkan penanaman jangka pendek sel darah keseluruhan atau sel mononuklear yang diasingkan daripada darah dengan antigen mikobakteria tuberkulosis secara in vitro, diikuti dengan penentuan kepekatan IFN-γ atau mengira bilangan T-limfosit yang mensintesis IFN-γ. Kepekatan interferon yang disintesis dalam tabung uji ditentukan oleh ELISA menggunakan antibodi monoklonal yang mengikat IFN-γ. Kemudian, menggunakan penentukuran standard IFN-γ, kepekatannya dalam tabung uji atau telaga plat ditentukan.

Dalam ujian Elispot, bilangan sel T yang mensintesis IFN-γ dikira pada permukaan hidangan yang disalut dengan antibodi kepada IFN-γ.

Pembangun diagnostik induksi IFN-γ in vitro, yang diluluskan oleh Pentadbiran Makanan dan Ubat-ubatan AS, mendakwa bahawa ujian itu tidak dapat membezakan jangkitan tuberkulosis laten daripada tuberkulosis aktif. Oleh itu, di kawasan yang mempunyai kadar jangkitan yang tinggi, ujian tidak mempunyai nilai diagnostik langsung. Walau bagaimanapun, di negara kita, ia boleh digunakan untuk membezakan jangkitan tuberkulosis pada kanak-kanak daripada alahan selepas vaksinasi, serta untuk menilai tahap imuniti khusus semasa rawatan.

Pada masa ini, sistem ujian domestik untuk menentukan induksi sintesis IFN-γ oleh antigen tuberkulosis tertentu secara in vitro sedang menjalani kajian.

Status imun dan perjalanan tuberkulosis, immunocorrection

Semasa rawatan tuberkulosis, perubahan dalam antigenemia dan keadaan sistem imun berlaku pada orang.

Data mengenai perubahan dalam eksudat dan tisu sebahagian besarnya bercanggah. Satu-satunya perkara yang boleh diperhatikan dengan justifikasi penuh ialah granuloma tuberkulosis, sebagai peraturan, mengandungi sejumlah besar T-limfosit yang diaktifkan.

Adalah masuk akal untuk memikirkan dua lagi perkara yang diperlukan untuk memahami peranan mekanisme imunologi dalam rawatan tuberkulosis pada manusia:

  • Pesakit AIDS mempunyai insiden yang sangat tinggi untuk membangunkan pelbagai rintangan dadah;
  • Dalam kes rintangan dadah berbilang (dan jika tiada jangkitan HIV), gangguan imun (terutamanya imuniti sel T) amat ketara.

Dalam batuk kering, pelbagai kaedah immunocorrection digunakan secara meluas: pertama sekali, ini adalah ubat-ubatan yang bertindak terutamanya pada imuniti sel T dan sistem fagosit mononuklear (hormon timus, isofon, licopid, polyoxidonium, dll.), serta seluruh (dilemahkan) mikobakteria dan komponennya.

Diagnostik biologi molekular tuberkulosis

Kaedah biologi molekul dalam diagnostik penyakit berjangkit terutamanya termasuk kaedah berdasarkan manipulasi bahan genomik patogen bakteria dan virus untuk mengenal pasti bahan genetik tertentu - bahagian DNA dengan urutan nukleotida khusus untuk spesies tertentu atau strain patogen, untuk menganalisis urutan DNA tertentu dalam gen yang menentukan kepekaan patogen terhadap ubat tertentu, serta untuk menganalisis aktiviti patogen tertentu. Kaedah biologi molekul telah meluas dalam penyelidikan saintifik dan aplikasi praktikal dalam diagnostik dan pemantauan pelbagai jangkitan bakteria dan virus selepas penemuan tindak balas rantai polimerase pada tahun 1985 oleh Carrie Mullis (pemenang Hadiah Nobel. 1989).

Prinsip dan keupayaan kaedah tindak balas rantai polimerase

PCR membenarkan penguatan (pendaraban) jujukan nukleotida (serpihan DNA patogen) dalam tabung uji dalam beberapa jam sebanyak berjuta-juta kali. Menjalankan tindak balas dengan kehadiran rantai DNA tunggal menentukan sensitiviti analisis yang sangat tinggi.

Urutan nukleotida bahagian tertentu rantaian DNA menentukan keunikan genetik mikroorganisma, yang menerangkan kekhususan tinggi PCR.

Kepentingan kaedah ini untuk pengesanan dan kajian ciri-ciri Mycobacterium tuberculosis adalah disebabkan oleh ciri-ciri biologi mikroorganisma, yang mempunyai pertumbuhan yang sangat perlahan: masa penggandaan DNA Mycobacterium tuberculosis semasa penanaman mereka adalah 12-24 jam.

Prinsip kaedah PCR adalah penguatan - berbilang, berjuta-juta kali pendaraban bahagian urutan DNA tertentu dalam mikrovolume tabung uji dengan pengulangan kitaran tiga peringkat tindak balas berikut, setiap satu berlaku dalam rejim suhu yang berbeza:

  • Peringkat I - denaturasi DNA untai dua apabila dipanaskan dengan perbezaan rantainya;
  • Peringkat II - pengikatan pelengkap (hibridisasi) primer (oligonukleotida penyebuan) dengan bahagian akhir rantai serpihan DNA khusus yang dipilih untuk penguatan;
  • Peringkat III – penyiapan rantai serpihan DNA menggunakan polimerase DNA termostable.

Untuk amplifikasi, tabung uji mesti mengandungi molekul DNA matriks. Empat jenis deoksinukleosida trifosfat (nukleotida) yang mengandungi bes nitrogen yang sepadan: adenina (A), timin (T), guanina (G), sitosin (C); oligonukleotida penyebuan buatan (primer) yang terdiri daripada 18-20 pasangan asas; enzim termostabil, polimerase DNA, dengan suhu optimum 68-72 ° C, dan ion magnesium.

Kekhususan PCR bergantung pada pilihan serpihan DNA. Selaras dengannya, oligonukleotida primer mengapit disintesis. Kekhususan hibridisasi dan penyiapan rantai DNA ditentukan oleh prinsip pelengkap pasangan bes nitrogen berikut: adenine-thymine, guanine-cytosine.

Untuk menentukan genom mikobakteria kompleks tuberkulosis, sasaran penguatan yang paling berkesan dalam kebanyakan sistem ujian ialah serpihan DNA IS6110, yang dalam kebanyakan strain mikobakteria tuberkulosis mempunyai bilangan pengulangan yang ketara (10-20) dalam genom, yang memastikan, bersama-sama dengan kekhususan, sensitiviti tinggi analisis. Pada masa yang sama, strain mikobakteria tuberkulosis dengan sebilangan kecil ulangan atau ketiadaan serpihan IS6110 telah diterangkan.

Pengekstrakan molekul DNA daripada sampel biologi

Untuk melakukan PCR, molekul DNA patogen mesti diasingkan daripada bahan biologi dalam jumlah minimum, dengan jumlah minimum DNA tidak spesifik dan pelbagai perencat enzim - polimerase DNA.

Penyediaan sampel mesti dijalankan di bawah keadaan yang menghalang pencemaran silang sampel yang dikaji dengan molekul DNA terpencil. Ini memerlukan rawatan awal bilik dengan cahaya ultraviolet, lantai dan permukaan kerja meja dan peranti - dengan penyelesaian yang mengandungi klorin. Ia juga perlu menggunakan sarung tangan bersih, tabung uji pakai buang dan petua untuk pipet automatik.

Untuk mengasingkan DNA Mycobacterium tuberculosis daripada sampel klinikal (cecair serebrospinal, lavage bronkial) yang tidak mengandungi sejumlah besar leukosit, serpihan selular atau garam, ia adalah mencukupi untuk mengempar sampel pada 3-4 ribu putaran seminit, tambah 20-30 µl 20-10 µl larutan sedimen dan C3000000000 kepada sentrifuge. 30 minit.

Penyediaan sampel kahak memerlukan pencairan yang cekap, biasanya menggunakan 4% natrium hidroksida dan N-asetil-L-sistein (NALC) pada 50-80 mg setiap sampel, bergantung kepada kelikatan sampel. Penyelesaian NALC hendaklah disediakan ex tempore, atau serbuk NALC boleh ditambah kering terus kepada sampel. Selepas pencairan, sampel hendaklah disentrifugasi selama 15 minit pada 3,500-4,000 rpm (3,000 g) dalam 50 ml tiub penutup skru, iaitu di bawah keadaan yang sama yang disyorkan untuk penyediaan kahak pra-kultur.

Untuk mengekstrak DNA daripada sedimen, kaedah berdasarkan penggunaan larutan 5-6 molar guanidine isothiocyanate sebagai reagen lysing dan zarah silikon oksida mikroporous ("bumi diatom") yang paling kerap digunakan untuk molekul DNA sorb. Bahan bukan spesifik, termasuk perencat yang mungkin, kemudian dibasuh dalam larutan 2.5 molar guanidine isothiocyanate dan larutan etanol, selepas itu molekul DNA dinyahserap dalam air, dan sampel ini digunakan untuk melakukan PCR. Untuk memudahkan teknologi pengekstrakan DNA, "bumi diatom" sering digantikan oleh mikrozarah magnet yang disalut dengan silikon oksida. Dalam kes ini, pendirian magnet khas untuk tiub mikro digunakan untuk memendakan zarah dan bukannya sentrifugasi.

Kaedah asal pemisahan imunomagnet mikobakteria dengan pengekstrakan DNA patogen seterusnya telah dibangunkan di Rusia. Untuk pemisahan imunomagnet mikobakteria tuberkulosis, ferropartikel bersaiz 3-5 μm, disalut dengan silikon oksida, digunakan, yang mana antibodi poliklonal (arnab) kepada mikobakteria tuberkulosis dilampirkan melalui ikatan kimia. Sampel kahak selepas lisis alkali dineutralkan dengan larutan Tris-HCl berasid dan diinkubasi dengan sorben imunomagnet. Kemudian imunoferropartikel dikumpul menggunakan batang magnet dengan hujung yang boleh diganti, dipindahkan ke tiub mikro, dan dimendakan. 20-30 μl larutan Triton X-100 2% ditambah dan dipanaskan selama 30 minit pada suhu 90 o C. Supernatan digunakan sebagai matriks DNA untuk analisis PCR.

Masalah yang sukar ialah pengekstrakan DNA mycobacterium tuberkulosis daripada spesimen biopsi. Untuk lisis biopsi, enzim proteinase K digunakan pada kepekatan akhir 200-500 mg/l pada suhu 56 o C semalaman. Kemudian, ia diekstrak menggunakan salah satu kaedah yang diketahui. Lebihan DNA tidak spesifik dalam analisis PCR spesimen biopsi sering menyebabkan perencatan tindak balas, yang memerlukan pengekstrakan DNA berulang.

Kaedah pengesanan hasil

Selepas selesai tindak balas, serpihan DNA patogen yang diperkuat dikenal pasti menggunakan pelbagai kaedah.

Kaedah elektroforesis gel terkenal. Dalam kes ini, serpihan DNA yang diperolehi dikenal pasti melalui kawalan positif yang mengandungi serpihan DNA khusus yang dikehendaki, atau dengan saiz yang diketahui sebelumnya (bilangan pasangan nukleotida) serpihan, yang ditentukan menggunakan penanda molekul piawai.

Dengan kehadiran pewarna tertentu - etidium bromida, yang termasuk dalam DNA bertali dua, serpihan DNA yang disintesis didedahkan sebagai jalur yang bersinar di bawah pengaruh cahaya ultraviolet.

Saiz serpihan DNA, ditentukan oleh elektroforesis berdasarkan jarak perjalanan dari permulaan, mesti sepadan dengan penanda berat molekul yang diketahui atau kawalan positif.

Kaedah lain untuk menentukan keputusan PCR adalah berdasarkan penghibridan produk PCR beruntai tunggal dengan oligonukleotida pelengkap - probe DNA yang dilabelkan dengan biotin, diikuti dengan pengesanan menggunakan tindak balas enzim dengan, sebagai contoh, mengikat konjugat fosfatase streptavidin-alkali kepada biotin.

Berdasarkan jenis pengesanan ini, penganalisis PCR telah dicipta di mana pengesanan keputusan PCR dijalankan secara automatik hasil daripada membaca ketumpatan optik dalam sampel selepas tindak balas enzim berlaku.

Kelemahan kaedah ini termasuk kemungkinan pencemaran dalam makmal dengan serpihan molekul DNA yang agak pendek. Apabila molekul ini memasuki sampel yang baru diuji, ia menjadi matriks untuk PCR dan membawa kepada keputusan positif palsu.

Dalam hal ini, untuk mengelakkan keputusan positif palsu, peraturan ketat diperkenalkan untuk mengasingkan dan mengasingkan bilik: untuk pengekstrakan DNA daripada sampel biologi; bilik untuk pengesanan keputusan (elektroforesis) dari zon bersih. Bilik ini mewakili zon kemungkinan pencemaran. Satu lagi zon terpencil ialah bilik bersih untuk memasukkan sampel DNA yang dikaji ke dalam tabung uji dengan campuran tindak balas untuk PCR. Dan akhirnya, diandaikan bahawa peranti utama - penguat DNA - harus dibawa keluar ke bilik yang berasingan, mungkin pejabat.

Untuk mengelakkan pencemaran oleh produk tindak balas terdahulu - amplikon, beberapa sistem ujian PCR mengandungi uridin deoxynucleoside dan bukannya timidin deoxynucleoside, yang dibina dalam kedudukan yang sepadan semasa sintesis rantai in vitro, iaitu timin bes nitrogen yang terdapat dalam DNA asli digantikan dengan urasil. Uracil DNA glycosylase yang ditambahkan pada campuran tindak balas bahan yang dianalisis hanya memusnahkan serpihan yang mencemari dengan deoxyuridine, tetapi bukan DNA yang dianalisis asli yang mengandungi deoxythymidine. Pemanasan seterusnya pada 94 o C menyahaktifkan enzim ini dan tidak mengganggu penguatan dalam PCR.

Terdapat sistem ujian berdasarkan penguatan isoterma rRNA, yang mana transkripsi terbalik dan sintesis molekul DNA mula-mula dilakukan. yang seterusnya adalah matriks untuk sintesis seterusnya molekul RNA. Amplikon RNA dikesan menggunakan probe DNA bernoda acridine semasa hibridisasi dalam larutan tiub tindak balas. Kaedah ini, sebagai tambahan kepada sensitiviti yang tinggi, mempunyai kelebihan menjalankan analisis dalam satu tiub, yang menghalang pencemaran. Menurut penulis, sensitiviti kaedah ini dalam sampel pernafasan mencapai 90% dengan kekhususan 99-100%.

Kaedah pengesanan baharu dilaksanakan dalam PCR masa nyata. Kaedah ini berbeza terutamanya dalam PCR dan pengesanan keputusannya dijalankan serentak dalam satu tabung uji tertutup. Ini bukan sahaja secara teknologi memudahkan kaedah analisis, tetapi juga menghalang pencemaran premis makmal dan sampel oleh produk PCR terdahulu.

Dalam PCR masa nyata, keputusan dikesan oleh pendarfluor yang timbul daripada penghibridan probe DNA fluorogenik dengan serpihan DNA tertentu yang dikuatkan semasa PCR. Struktur probe DNA fluorogenik dibina sedemikian rupa sehingga penanda pendarfluor dilepaskan hasil daripada tindak balas enzim atau menjauhkan diri daripada molekul pelindapkejutan pendarfluor hanya apabila penghibridan khusus dengan molekul DNA yang dikehendaki diperkuatkan semasa PCR. Apabila bilangan molekul yang dihibridkan dengan probe meningkat, peningkatan dalam pendarfluor ke tahap yang boleh dikesan adalah berkadar dengan bilangan molekul produk yang dikuatkan. Oleh kerana bilangan molekul serpihan DNA digandakan semasa setiap kitaran PCR, nombor kitaran dari mana pendarfluor dikesan dan meningkat adalah berkadar songsang dengan bilangan molekul DNA dalam sampel asal. Jika beberapa kepekatan molekul yang diketahui berbeza daripada serpihan DNA mikobakterium tuberkulosis yang sepadan dimasukkan ke dalam tindak balas sebagai penentukur, maka bilangan genom DNA dalam bahan yang sedang dikaji boleh dikira menggunakan program komputer.

Setiap sampel standard diduakan. Kriteria kuantitatif ialah bilangan minimum kitaran PCR yang diperlukan untuk permulaan dan pertumbuhan pendarfluor yang boleh dikesan. Paksi absis ialah bilangan kitaran; paksi ordinat ialah nilai pendarfluor. Kepekatan DNA adalah berkadar songsang dengan bilangan kitaran yang diperlukan untuk pendarfluor muncul. Tingkap di lajur kanan (21-32) menunjukkan nombor kitaran untuk kepekatan yang sepadan. Perbezaan antara kepekatan 10 kali ganda serpihan DNA 10 2 -10 6 ml ialah 3.2-3.4 kitaran. Bagi dua pesakit, kepekatan serpihan IS6110 adalah kira-kira 10 3 /ml dan 10 4 /ml. Dengan mengambil kira bilangan ulangan (6-20) serpihan yang dianalisis dalam genom Mycobacterium tuberculosis, bilangan Mycobacterium tuberculosis dalam sampel klinikal adalah kira-kira 100 dan 1000 sel, masing-masing.

Penggunaan PCR dalam diagnosis tuberkulosis

Kaedah PCR digunakan sepenuhnya untuk diagnosis cepat tuberkulosis - pengesanan Mycobacterium tuberculosis dalam sampel klinikal: kahak, basuhan bronkial, eksudat pleura, air kencing, cecair serebrospinal, tusukan osteolisis, aspirasi saluran kemaluan wanita dan pelbagai biopsi. Dalam satu kajian di Holland mengenai kira-kira 500 sampel basuhan kahak dan bronkial daripada 340 pesakit dengan diagnosis tuberkulosis pulmonari yang disahkan, sensitiviti perbandingan kaedah PCR, kultur dan mikroskopi smear telah dikaji. Kepekaan analisis masing-masing ialah 92.6, 88.9 dan 52.4%. Kekhususan semua kaedah adalah kira-kira 99%.

Perbandingan dibuat terhadap kecekapan pengesanan Mycobacterium tuberculosis menggunakan mikroskop smear, menyemai pada medium Lowenstein-Jensen, sistem ujian VASTES dan analisis PCR. PCR menunjukkan sensitiviti 74.4%, mikroskop - 33.8%, menyemai pada medium pepejal - 48.9% dan VASTES - 55.8%. Purata masa pengesanan untuk menyemai pada medium Lowenstein-Jensen ialah 24 hari. VASTES - 13 hari, PCR - 1 hari.

Potensi untuk menggunakan PCR sebagai kaedah sensitif dan pantas untuk memantau keberkesanan rawatan tuberkulosis juga dibincangkan.

Pengesanan DNA Mycobacterium tuberculosis oleh kaedah PCR dengan kemoterapi berkesan ditentukan dalam tempoh yang lebih lama - secara purata 1.7 bulan berbanding perkumuhan bakteria yang ditentukan oleh mikroskop pendarfluor, dan 2.5 bulan berbanding pemeriksaan bakteriologi.

Diagnosis bentuk tuberkulosis ekstrapulmonari

Kepentingan PCR sebagai kaedah sensitif adalah sangat bagus untuk bentuk extrapulmonary, kerana dalam bentuk ini kaedah klinikal dan radiologi dan kaedah bakteriologi tradisional untuk menentukan Mycobacterium tuberculosis dalam bahan diagnostik adalah tidak berkesan.

Apabila memeriksa sampel air kencing, keputusan analisis PCR adalah positif dalam 16 daripada 17 pesakit dengan tuberkulosis aktif sistem kencing dan negatif dalam 4 pesakit dengan tuberkulosis buah pinggang tidak aktif dan 39 pesakit dengan penyakit bukan tuberkulosis sistem kencing.

Kecekapan analisis PCR dalam kajian aspirasi sumsum tulang pada pesakit dengan demam yang tidak diketahui genesis dengan sifat penyakit tuberkulosis yang disyaki telah ditunjukkan. Untuk diagnosis limfadenitis tuberkulosis pada kanak-kanak, 102 aspirasi tusukan dan sampel biopsi 67 kanak-kanak yang disyaki limfadenitis tuberkulosis telah dikaji. Keputusan positif diperoleh: dengan PCR masa nyata - 71.6%, mikroskop pendarfluor - 46.3%, kajian budaya - 41.8%. Dalam kajian 50 biopsi nodus limfa pada pesakit dengan penyakit calar kucing, semua keputusan adalah negatif. Oleh itu, kekhususan 100% analisis PCR telah ditunjukkan. Dalam kerja yang sama, kemungkinan mengesan M. avium ditunjukkan dalam biopsi tusukan nodus limfa.

Diagnosis tuberkulosis alat kelamin wanita dalam ketidaksuburan diketahui sebagai salah satu masalah diagnostik yang paling sukar. Keputusan positif diperolehi dalam kajian PCR biopsi endometrium, aspirasi endometrium, dan sampel cecair kantung Douglas dalam 14 (56%) daripada 25 pesakit yang diperiksa secara laparoskopi dengan disyaki batuk kering. Kajian mikroskopi smear dan kultur masing-masing menghasilkan 1 dan 2 keputusan positif. Kes-kes ini juga positif PCR. Kebanyakan keputusan PCR-positif adalah dalam kes dengan ciri ciri tuberkulosis mengikut pemeriksaan histologi; bilangan yang lebih kecil adalah dalam kes yang disyaki tuberkulosis mengikut laparoskopi. Hanya satu keputusan PCR positif diperolehi jika tiada data laparoskopi untuk tuberkulosis.

Apabila mendiagnosis bentuk tuberkulosis ekstrapulmonari, doktor sering mempunyai soalan tentang kemungkinan mengenal pasti patogen apabila memeriksa sampel darah menggunakan kaedah PCR. Data literatur menunjukkan bahawa pengesanan DNA Mycobacterium tuberculosis daripada sampel darah adalah mungkin dalam bentuk jangkitan HIV lanjutan. DNA Mycobacterium tuberculosis dikesan hanya dalam tuberkulosis umum pelbagai organ pada pesakit dengan buah pinggang yang dipindahkan dan imunosupresi.

trusted-source[ 59 ], [ 60 ], [ 61 ], [ 62 ], [ 63 ]

Pengenalpastian spesies mikobakteria

Kaedah PCR boleh menjadi agak berkesan untuk mengenal pasti cepat mikobakteria kompleks tuberkulosis dan beberapa jenis mikobakteria bukan tuberkulosis selepas mendapat pertumbuhan utamanya. Dalam kes ini, penggunaan PCR boleh menjimatkan 7-10 hari yang diperlukan untuk pengenalan budaya seterusnya hasil positif. Kajian PCR secara teknikalnya sangat mudah, kerana ia tidak memerlukan penyediaan sampel bahan klinikal yang kompleks untuk mencapai sensitiviti yang tinggi. Apabila memeriksa 80 budaya positif dalam sistem ujian sedemikian (MB BacT. oleh Organon), semua keputusan analisis PCR positif adalah khusus dan telah dijalankan dalam masa 1 hari. Untuk mengenal pasti jenis mikobakteria lain apabila ia diperolehi dalam kultur, DNA patogen dihibridkan dengan probe DNA tertentu yang dilabelkan dengan acridine, dan strain dikesan melalui penampilan chemiluminescence menggunakan chemiluminometer atau pada jalur nitroselulosa dengan penilaian visual selepas penghibridan. Kit ini mengenal pasti bilangan spesies yang terhad: Kompleks Mycobacterium tuberculosis, M. avium, M. avium complex, M. kansasii, dan M. gordonae.

A. Telenti et al. juga membangunkan kaedah yang agak mudah dan murah untuk mengenal pasti spesies mikobakteria penting secara klinikal berdasarkan PCR dan rawatan seterusnya dengan dua enzim sekatan (enzim yang mempunyai keupayaan untuk memotong molekul DNA pada titik tertentu). Dalam kes ini, serpihan DNA yang mengekod protein kejutan haba (65 kDa) dikuatkan, selepas itu serpihan DNA yang diperoleh dalam PCR, 439 pasangan nukleotida dalam saiz, dirawat secara berasingan dengan dua enzim - Bste II dan Нае III. Kemudian, menggunakan elektroforesis gel agarose, kedua-dua produk yang diperolehi dianalisis, menentukan saiznya (bilangan pasangan nukleotida) menggunakan satu set serpihan DNA standard (penanda DNA molekul) daripada 100 hingga 1000 pasangan nukleotida panjangnya. Dalam setiap spesies yang ditakrifkan (M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M.fortuitum) 2 atau 3 serpihan DNA yang berbeza saiz ditemui untuk setiap enzim sekatan. Gabungan serpihan DNA yang terhasil daripada saiz yang berbeza membolehkan spesies ini dibezakan antara satu sama lain.

Satu teknologi untuk microarrays DNA biologi sedang dibangunkan yang akan membantu mengenal pasti lebih daripada 100 spesies mikobakteria dalam satu kajian.

Pengenalpastian spesies juga boleh dilakukan menggunakan amplifikasi PCR bagi rantau pembolehubah 16S rRNA diikuti dengan penjujukan amplikon berbanding dengan struktur primer yang sepadan, yang membolehkan pengenalpastian lebih daripada 40 spesies mikobakteria.

PCR juga boleh digunakan untuk mengenal pasti spesies dalam kompleks mycobacterium tuberkulosis, termasuk pembezaan antara M. bovis dan M. bovis BCG. Ini dilakukan dengan menganalisis kehadiran atau ketiadaan gen tertentu di kawasan genom RD1, RD9, dan RD10. RD1 tiada dalam M. bovis BCG, tetapi terdapat dalam spesies virulen, termasuk M. bovis.

Penentuan kerentanan dadah Mycobacterium tuberculosis menggunakan PCR

Tugas kaedah genetik molekul untuk menentukan sensitiviti ubat atau rintangan Mycobacterium tuberculosis dikurangkan kepada mengenal pasti mutasi dalam jujukan nukleotida tertentu gen yang diketahui. Kaedah utama adalah berdasarkan sama ada pada bacaan langsung (jujukan) jujukan ini selepas amplifikasi, atau pada hibridisasi serpihan DNA berlabel biotin yang dikuatkan semasa PCR dengan probe DNA. Kedua-dua pilihan melibatkan mengenal pasti penggantian dalam jujukan nukleotida yang, apabila menggunakan probe DNA, membawa kepada ketiadaan atau hibridisasi tidak lengkap pada membran nitroselulosa menggunakan konjugat enzim (streptavidin-alkali fosfatase) - kaedah LIPA-Rif-TB.

Kaedah mengukur pendarfluor dalam probe DNA tetap tempatan pada kawasan mikro yang melengkapi mutasi yang diketahui dalam kawasan gen diperkuat PCR yang bertanggungjawab terhadap kepekaan atau rintangan dadah dipanggil kaedah microbiochips. Algoritma asas untuk menjalankan kajian ini adalah seperti berikut. Selepas DNA diasingkan daripada sampel klinikal atau kultur mikobakteria, PCR mesti dilakukan untuk menguatkan serpihan gen groB yang sepadan yang bertanggungjawab terhadap kepekaan dadah kepada rifampisin, atau gen katG dan inhA yang mengekodkan protein mikobakteria yang bertanggungjawab terhadap kepekaan terhadap isoniazid. Keputusan PCR dinilai menggunakan elektroforesis gel agarose, yang mengesahkan penerimaan serpihan DNA yang sepadan dengan panjang yang dikehendaki. Kemudian, pusingan ke-2 PCR dilakukan untuk memperkenalkan label pendarfluor ke dalam DNA. Keputusan PCR sekali lagi disahkan oleh elektroforesis gel. Selepas ini, hibridisasi dijalankan (pengeraman semalaman) dengan pembasuhan seterusnya bahan yang diperolehi pada biocip, yang merupakan sejumlah besar rantai DNA pendek (probe) yang dipasang pada plat kaca kecil, pelengkap kepada urutan nukleotida jenis mikobakteria tuberkulosis sensitif dadah pada titik mutasi yang mungkin. serta kepada jujukan mutan yang bertanggungjawab terhadap rintangan dadah. Lokasi probe DNA pada plat ditakrifkan dengan ketat, dan tahap pendarfluor yang diperhatikan semasa hibridisasi untuk menentukan keputusan menggunakan peranti bacaan khas ditubuhkan. Dalam hal ini, keputusan analisis ditentukan menggunakan program komputer khas.

Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, kaedah alternatif untuk menentukan sensitiviti ubat Mycobacterium tuberculosis telah dibangunkan berdasarkan teknologi PCR masa nyata, membolehkan kajian ini dijalankan dalam mod tabung uji tertutup.

Rajah 13-13 menunjukkan hasil analisis kultur klinikal Mycobacterium tuberculosis dalam menentukan rintangan dadah terhadap rifampisin menggunakan PCR masa nyata: 218 - sampel kawalan (sensitif kepada rifampicin); 93 - kawalan positif untuk mutasi Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - kawalan positif untuk mutasi Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - sampel eksperimen. Hasil pengiraan lengkung kinetik penguatan untuk 4 saluran: saluran 1: 393 - kawalan positif untuk mutasi Ser-Trp TCG-TGG; saluran 2: 4482 - kawalan positif untuk mutasi Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - sampel eksperimen; saluran 4: lengkung kinetik penguatan semua sampel yang mengambil bahagian dalam eksperimen. Kawalan positif tindak balas penguatan. Kesimpulan: Analisis mendedahkan mutasi berikut yang menentukan ketahanan terhadap rifampicin: dalam sampel 162,163,172,295 - Ser-Leu TCG-TTG. Prinsip yang sama digunakan untuk menentukan rintangan dadah terhadap isoniazid oleh gen katG dan inhA, yang menentukan mutasi yang paling kerap.

trusted-source[ 64 ], [ 65 ], [ 66 ], [ 67 ], [ 68 ], [ 69 ]

Pengenalpastian strain Mycobacterium tuberculosis

Kaedah pengenalpastian terikan Mycobacterium tuberculosis yang paling banyak dikaji ialah teknologi yang dipanggil polimorfisme panjang serpihan sekatan (RFLP) dan yang berasaskan pemecahan (sekatan) DNA Mycobacterium tuberculosis oleh enzim Pvu II dan penghibridan seterusnya serpihan yang diperoleh dengan urutan tertentu tertentu pada DNA10 unsur ulangannya IS61. Kebolehubahan intraspesifik direalisasikan disebabkan oleh bilangan ulangan IS6110 yang berbeza dan lokasinya pada DNA, serta kepelbagaian jarak antara titik serangan tertentu enzim sekatan (tapak sekatan) dan elemen IS6110. Teknologi ini sangat kompleks dan intensif buruh. Selepas merawat DNA yang diasingkan daripada kultur mycobacterium tuberkulosis dengan enzim sekatan, elektroforesis gel dilakukan, kemudian serpihan DNA dengan panjang yang berbeza dipindahkan ke membran nitroselulosa, hibridisasi dengan serpihan unsur IS6110, dan hasilnya dikesan menggunakan tindak balas enzimatik. Corak jalur khusus yang terhasil mencirikan DNA strain mycobacterium tuberkulosis tertentu. Analisis komputer mendedahkan identiti atau hubungan strain. Walaupun fakta bahawa kaedah RFLP adalah yang paling diskriminasi, iaitu ia mendedahkan bilangan terbesar perbezaan dalam strain yang dianalisis, ia tidak berkesan dengan bilangan kecil (kurang daripada 5) ulangan IS6110, diperhatikan dalam beberapa strain. Rajah 13-14 menunjukkan keputusan menaip RFLP bagi strain.

Alternatif mungkin kaedah spoligotaip - analisis polimorfisme jujukan DNA spacer - perantaraan antara ulangan langsung rantau DR. Semasa menjalankan spoligotaip strain, PCR dijalankan dengan primer yang mengehadkan rantau DR, selepas itu serpihan dengan panjang yang berbeza terbentuk, yang menghibridkan dengan kawasan DNA perantaraan yang berubah-ubah. Analisis jujukan spacer rantau DR nampaknya, menurut penyelidik, lebih mudah, lebih produktif dan sesuai untuk pemeriksaan utama strain dan analisis epidemiologi awal, serta untuk mengkaji bahan klinikal secara langsung.

Jelas sekali, kaedah yang lebih berkesan dan boleh diakses secara teknologi ialah VNTR (singkatan perkataan Inggeris), atau kaedah menentukan bilangan pembolehubah ulangan bersamaan tepat dalam DNA mycobacterium tuberculosis. Kaedah ini hanya berdasarkan penggunaan PCR dan tidak memerlukan manipulasi tambahan. Oleh kerana bilangan ulangan tandem dalam strain yang berbeza dan dalam lokus yang berbeza adalah berbeza, serpihan saiz yang berbeza ditentukan dan dianalisis pada elektroforegram produk PCR yang terhasil. Menurut penyelidik, dengan bantuan VNTR, tahap diskriminasi strain yang lebih besar dicapai berbanding dengan kaedah RFLP.

Banyak perhatian telah diberikan dalam beberapa tahun kebelakangan ini kepada penyebaran strain Mycobacterium tuberculosis dari keluarga W-Beijing (kadang-kadang dipanggil strain Beijing), yang sebahagian besarnya tahan dadah.

Keperluan asas untuk kualiti penyelidikan biologi molekul

trusted-source[ 70 ], [ 71 ], [ 72 ], [ 73 ]

Dokumen pengawalseliaan utama untuk menjalankan PCR

Perintah Kementerian Kesihatan Persekutuan Rusia: No. 45 dari 7.02.2000; No 109 dari 21.03.2003; No 64 dari 21.02.2000. Garis Panduan: 1.3.1888-04 "Organisasi kerja semasa penyelidikan PCR bahan yang dijangkiti agen biologi patogenik kumpulan patogenik III-IV"; 1.3.1794-03 "Organisasi kerja semasa penyelidikan PCR bahan yang dijangkiti mikroorganisma kumpulan patogenik I-II". 2003; 3.5.5.1034-01 "Bahan kuman bahan ujian yang dijangkiti bakteria kumpulan patogenik I-IV apabila bekerja dengan kaedah PCR", 2001. Lampiran 11 kepada Arahan kaedah bersatu penyelidikan mikrobiologi dalam pengesanan, diagnosis dan rawatan tuberkulosis.

trusted-source[ 74 ], [ 75 ], [ 76 ]

Kakitangan

Kajian biologi molekul boleh dijalankan oleh doktor diagnostik makmal klinikal, ahli bakteriologi, ahli virologi, ahli biologi makmal diagnostik klinikal, serta pakar dengan pendidikan perubatan menengah yang telah menjalani pengkhususan dan latihan lanjutan mengikut cara yang ditetapkan.

Susunan premis makmal

Kemudahan makmal berikut diperlukan:

  • Kawasan pemprosesan sampel - makmal yang disesuaikan untuk bekerja dengan agen berjangkit kumpulan patogenik III-IV, mengikut Garis Panduan Metodologi 13.1888-04.
  • Kawasan untuk menyediakan campuran tindak balas PCR ialah bilik makmal yang menyediakan perlindungan daripada pencemaran makmal dalaman - kawasan "bersih".
  • • Jika elektroforesis atau hibridisasi digunakan untuk menganalisis produk PCR, bilik makmal di mana serpihan DNA yang dikuatkan diekstrak daripada tiub amplifikasi dan, dengan itu, boleh memasuki persekitaran, mengikut keperluan untuk makmal PCR (Garis Panduan Metodologi 1.3.1794-03, Garis Panduan Metodologi 1.3.1888-04) mesti dinyatakan sepenuhnya dalam paragraf sebelumnya. Pergerakan mana-mana kakitangan, peralatan, sebarang bahan dan objek dari kawasan elektroforesis ke kawasan pemprosesan sampel dan kawasan "bersih", serta pemindahan udara melalui sistem pengudaraan atau akibat draf, mesti dikecualikan. Kawasan ini tidak diperlukan untuk pengesanan fluorimetrik produk PCR.
  • Bilik untuk dokumentasi dan pemprosesan keputusan dilengkapi dengan komputer dan peralatan pejabat yang diperlukan. Bilik ini mungkin mengandungi peralatan yang memastikan pengesanan produk PCR tanpa membuka tiub. - pengesan PCR pendarfluor dan kitar haba untuk PCR masa nyata.

Keperluan kebersihan dan epidemiologi untuk pemprosesan utama sputum adalah serupa dengan keperluan mikrobiologi standard untuk bekerja dengan Mycobacterium tuberculosis.

trusted-source[ 77 ], [ 78 ], [ 79 ], [ 80 ]

Set lengkap peralatan makmal untuk diagnostik PCR

Kit makmal termasuk peralatan untuk bilik berikut.

  • bilik penyediaan sampel, mengandungi peralatan berikut: hud aliran laminar kelas perlindungan II "SP-1.2": termostat keadaan pepejal dengan penutup yang dipanaskan untuk tiub uji Eppendorf; microcentrifuge pada 13,000 rpm; emparan ("Vortex"); peti sejuk dengan julat suhu dari -20 ° C hingga +10 ° C; pipet volum berubah-ubah siri "Proline"; pam dengan kelalang perangkap OM-1; rak pipet; rak stesen kerja 200x0.5 ml; rak stesen kerja 50x1.5 ml; rak untuk menyimpan tabung uji 80x1.5 ml;
  • bilik penyediaan campuran tindak balas: kotak PCR ruang pelindung ("Laminar-C. 110 cm); centrifuge "Vortex"; pipet volum berubah-ubah siri "Proline"; rak pipet; rak stesen kerja 200x0.2 ml; rak untuk menyimpan tabung uji 80x1.5 ml; peti sejuk dengan julat suhu dari -20 ° C hingga +10 ° C;
  • Bilik elektroforesis: ruang elektroforesis mendatar; sumber kuasa; transilluminator;
  • Penguat DNA atau penganalisis asid nukleik (PCR masa nyata) dengan komputer dan perisian; boleh diletakkan di mana-mana bilik yang ada. Jika teknologi PCR masa nyata digunakan, bilik elektroforesis tidak diperlukan.

trusted-source[ 81 ], [ 82 ], [ 83 ], [ 84 ]

Kawalan kualiti luaran

Untuk memastikan mereka memperoleh keputusan yang boleh dipercayai secara objektif, makmal mesti mengambil bahagian dalam sistem penilaian luaran kualiti penyelidikan makmal.

Peserta dalam sistem kawalan kualiti menerima: 12 ampul dengan penggantungan lyophilized sel bakteria, dua daripadanya mengandungi E. coli, 3 ampul dengan mikobakteria tuberkulosis (tekanan virulen) pada kepekatan 10 2 /ml; 3 ampul dengan sel dengan ketegangan yang serupa pada kepekatan 10 4 /ml; 2 ampul setiap satu dengan mikobakteria bukan tuberkulosis M. avium-intracellulare dan M. kansasii pada kepekatan 10 5 /ml.

Ujian yang dihantar untuk penilaian kualiti luaran telah diuji di dua makmal bebas dengan pengalaman luas dalam bidang ini.

trusted-source[ 85 ], [ 86 ]


Portal iLive tidak memberikan nasihat, diagnosis atau rawatan perubatan.
Maklumat yang diterbitkan di portal adalah untuk rujukan sahaja dan tidak boleh digunakan tanpa berunding dengan pakar.
Berhati-hati membaca peraturan dan dasar laman web ini. Anda juga boleh hubungi kami!

Hak Cipta © 2011 - 2025 iLive. Hak cipta terpelihara.